HPLC分析常见问题

1、HPLC分析常见问题张庆合,李彤大连依利特分析仪器有限公司色谱过程HPLC方法建立的步骤样品情况, 分离目的是否需要特殊的HPLC步骤、样品预处理等？选择设置检测器选择液相色谱法；预实验；估计最佳分离条件优化分离条件检查出现的问题或所需的特殊步骤论证方法使之进入常规实验室样品组分和性质情况样品组分和性质情况 所含化合物的数目 化合物的化学结构（官能团） 化合物的分子量 化合物的pKa值 化合物的UV光谱图 化合物在样品中的浓度范围 样品的溶解度分离的目的定量？一种物质检出？未知组分确认？纯化？要解析出样品的所有成分？准确度与精密度？方法应设计多少种不同的样品基质？特殊化合物样品形式（如：原料药

2、，一种或多种形态，环保样品等）一次将分析多少样品？牺牲样品分离度，如缩短柱长或加快流速。HPLC设备人员？柱恒温？梯度洗脱？方法通用性？样品预处理与检测可直接进样的溶液需稀释、pH缓冲、加入内标或其它定容操作必须首先溶解或提取处理的固体样品需预处理以除去干扰物和/或保护色谱柱或仪器不受损害的样品方法建立和论证期间可能问题方法建立和论证期间可能问题塔板数低：色谱柱选择，二次保留、峰形不好色谱柱易变性：色谱柱选择，二次保留的影响色谱柱寿命短：色谱柱选择、样品预处理、3 pH 7保留值变化：色谱柱平衡不够、样品需预处理、键合相流失定量精度差：校正、找出误差的来源出现新干扰峰：初始分离不够或初始样品无

3、代表性。分离的简单原则 出得来 分得开 尽量快液相色谱常见问题液相色谱常见问题不要总是首先埋怨不要总是首先埋怨色谱柱色谱柱!泵流速、压力不稳 泵内有气泡 溶剂过滤器阻塞 入口单向阀过滤片阻塞 泵中两种溶剂不互溶 柱塞密封泄漏 连接管路泄漏单向阀装配图 单向阀清洗1:4硝酸溶液、蒸馏水中超声清洗15分钟两次吹净里面的水份按原位置重新装配在泵头上在整体清洗单向阀组件无效时，拆开单向阀组件冲洗检查安装方向柱塞杆和密封环的维护 清洗柱塞杆后部 避免含盐流动相滞留在色谱系统 流动相与样品的过滤 溶剂过滤器与在线过滤器的清洗HPLC常用连接管检测器基本要求灵敏度高、线性范围宽、通用响应快、响应值不受温度及

4、流动相影响噪音低、漂移小死体积小对样品无破坏性定性定量信息方便便宜UV检测器常见故障 灯：基线躁声、灯失灵、灯能量 检测池：气泡、阻塞、污染 波长：波长准确性、选择基线噪声 样品或流动池污染 样品或参比池 中有气泡 记录仪或装置接地不良 检测器光源故障 连接件泄露 很小的气泡通过检测池 由泵的脉动引起的规则脉冲 有微粒通过检测池 进样阀样品环部分堵塞基线漂移 流动池污染 柱污染或固定相流失 检测器温度变化 检测器光源故障 原先的流动相未完全置换 溶剂储瓶污染 强吸附的组分从色谱柱中洗脱下来 微粒造成进样阀柱头部分堵塞 溶剂分层检测器气泡05101520250100200300400500600

5、700mVmin1. 柱头螺丝2. 过滤筛板3. 色谱柱管刃环4. 柱头压帽5. 色谱柱柱管 色谱柱结构零死体积连接2 -1 1 0 0 -1 0 -1 85 0 u m1 0 K VX 5 0 0 WD: 1 1 mm 3微米多孔二氧化硅微球固定相基质类型Si - O-HSi - O-HSi - O-HSi - O-HSi - O-H硅胶颗粒表面硅羟基键合相Si - O-HSi - O-SiSi - O-Si - O-SiSi - O-Si液相色谱固定相烷基键合固定相表面峰高或峰面积重复性差 进样体积不重复 检测器响应不正常 记录仪或工作站不正常 柱或检测器被样品超载 校准液或样品溶液或内标

6、物分解 保留时间不重复 溶质与固定相作用 色谱柱填充不良分析的准确度差 校准不适当 校准液或样品溶液或内标物分解 对内标物或欲测组分有未知干扰 溶质与固定相作用色谱柱的保护保护柱防止流动相及样品中杂质对色谱柱的损害色谱柱的保护色谱柱的保护 过滤所有的流动相及溶剂 预处理样品去除强保留的组分 周期性地用强吸脱溶剂冲洗色谱柱 避免色谱柱温度高于60C 流动相 pH值介于 3 到 7之间 用新配制的缓冲溶液和水作为流动相 冲洗缓冲溶液后在100%有机溶剂中封盖储存) 避免碰撞敲击色谱柱或接头过紧在pH 7或以上使用 键合致密的长链烷基固定相（C18、C8等） 硅溶胶工艺制的硅胶（Hypersil、K

7、romasil、Spherisorb、Zorbax），经封尾的色谱柱 有机枸橼酸与硼酸缓冲液，避免用磷酸盐、胺盐与碳酸盐） 保持0.010.05M的缓冲液浓度。 设定柱温 40C。 缓冲阳离子Li+ Na+ K+ NH+4 。 加碱性流动相改性剂保持长期分离重现性。HPLC中保留值与分离度变化 原 因柱间差异担体、键合的不同使用期间柱变化扰乱柱床，键合相丢失，硅胶担体溶解，非流出物质堆积堵塞柱外效应系统间：进样量大；进样阀与色谱柱之间和/或色谱柱与检测器之间的管道体积大；检测器体积大；接头体积大分离控制不好流动相组分改变，流速改变，温度改变柱平衡慢再平衡时间不足柱超载样品质量太大色谱柱常见问题

8、色谱柱常见问题 背压过高 柱头筛板杜塞 柱外死体积 柱间重复性 柱床塌陷鬼峰或假峰鬼峰或假峰 进样阀或注射器污染 样品溶剂与流动相不同 样品中有空气 流动相中杂质引起 20%到100%甲醇梯度选择性变化选择性变化 应用色谱柱是否正确? 固定相表面是否有未洗脱样品? 流动相pH、组成、温度等 键合功能团流失? 在评价条件下重新检测柱外效应柱外效应 小于3mm内径的色谱柱 进样阀和色谱柱、色谱柱和检测器之间用短的细内径的连接管 用无死体积接头 用较小体积的检测池 进样体积减小色谱峰分裂色谱峰分裂 柱外死体积 柱头填料污染 部分阻塞 进样阀密封问题 化合物一起洗脱色谱峰展宽色谱峰展宽所有的色谱峰展宽

9、 柱效降低 进样体积太大部分色谱峰展宽 上次进样洗脱的色谱峰 蛋白或聚合物等高分子量化合物色谱峰拖尾色谱峰拖尾部分色谱峰拖尾 次级保留效应 残留硅醇基的作用 在大峰的尾部有小峰所有色谱峰拖尾 柱外效应 柱头污染 重金属离子 色谱柱填充不理想前伸峰前伸峰 色谱柱没有充分平衡 在主峰前有小色谱峰负峰负峰 检测器输出信号的极性相反 样品的吸收小于流动相，流动相不纯 样品溶剂干扰 示差折光检测器中样品的折射率较低 进样中带入气泡 色谱柱问题检查 色谱柱填料种类和规格? 样品和流动相种类? 保留、选择性、柱效、峰形问题? 是否用色谱柱检测溶质混合物进行检测? 样品基质是什么? 样品是否经过过滤? 是否用

10、过滤的HPLC及溶剂? 色谱柱使用时间有多长? 色谱柱原来是否能够给出满意的结果? 是否更换或处理过色谱柱头的筛板? 色谱柱性能与原来的色谱柱存在差异? 请提供色谱分离的所有试验条件.色谱柱储存固定相储存溶剂储存溶剂反相(C18, C8, C4, etc.)甲醇或乙腈Phenyl甲醇或乙腈 CN (反相)乙腈CN (正相) 3:97Heptane:IPA NH2, Diol, Silica 3:97 Heptane:IPA Elite色谱柱再生 每次冲洗用40到60倍柱体积的溶剂； 再生前后应该比较塔板数、峰形和k 值，确定再生效果色谱柱的再生生反相 正相(C18, C8, Phenyl, CN (RP*) (Silica, NH2, CN, Diol)H2O:乙腈 90:10 1. 正己烷/氯仿甲醇2.二氯甲烷乙腈3.异丙醇THF4.二氯甲烷甲醇5.流动相流动相6. 色谱柱再生离子交换离子交换 蛋白提纯SAX, SCX, DEAE, NH2, CM (C18, C4, C8, Phenyl