仪器分析教学课件,荧光光度法课件

1、Molecular luminescence analysis第五章第五章分子发光分析法分子发光分析法分子发光分析法分子发光分析法荧光荧光磷光磷光化学发光化学发光生物发光生物发光散射光散射光分子发光分子发光第第5 5章章第一节第一节 分子荧光和磷光分析分子荧光和磷光分析本次课内容本次课内容荧光分析法概述荧光分析法概述5.1 分子荧光和磷光分析分子荧光和磷光分析 荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生 激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱 荧光与物质分子结构的关系荧光与物质分子结构的关系原理原理概概 述述n荧光光谱的范围较广，可以从荧光光谱的范围较广，可以从X光到红光到红外光谱区。外光谱区。n某些物质

2、受某些物质受紫外光紫外光照射后能发射比吸照射后能发射比吸收的紫外光波长更长的收的紫外光波长更长的紫外光荧光或紫外光荧光或可见荧光可见荧光。 分子荧光分析法分子荧光分析法Molecular fluorometry概概 述述 一种物质能否发射荧光，取决于它一种物质能否发射荧光，取决于它 的的分子结构分子结构和它所处的和它所处的环境条件环境条件。概概 述述分子结构：分子中含有分子结构：分子中含有共轭双键体系共轭双键体系，具，具 有吸收辐射能，产生有吸收辐射能，产生电子跃迁电子跃迁 的性质。的性质。环境条件：适当的辐射能照射，合适的温环境条件：适当的辐射能照射，合适的温 度、溶剂、酸碱度等。度、溶剂、

3、酸碱度等。5.1 分子荧光和磷光分析分子荧光和磷光分析5.1.1 原理原理1. 荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生 ？5.1 分子荧光和磷光分析分子荧光和磷光分析 激发态激发态 第一激发态最低振动能级第一激发态最低振动能级 基基 态态 s = 1/2（自旋量子数）（自旋量子数）M = 2s+1（电子能态多重性）（电子能态多重性）、n 电子电子S0S1S2荧光的产生荧光的产生分子的激发态分子的激发态单重态（单重态（S）：）：当处于当处于基态基态分子的电子都配对时，总分子的电子都配对时，总s = 0， 多重性多重性 M=1，这样的电子能态称为单重态。，这样的电子能态称为单重态。 单重电子激发态（单重

4、电子激发态（S1 ，S2）：）： 当基态分子的当基态分子的成对电子成对电子吸收光能之后，被激吸收光能之后，被激 发到某一发到某一激发态激发态上。如果它的上。如果它的自旋方向不变自旋方向不变， s=0，M=1，这时的激发态叫单重电子激发态。，这时的激发态叫单重电子激发态。分子的激发态分子的激发态 图示：图示： 单重电子单重电子激发态激发态单重态单重态 E分子的激发态分子的激发态三重电子激发态（三重电子激发态（T）：）： 处于处于激发态激发态的电子若通过分子内部的一的电子若通过分子内部的一些些能量转移能量转移，或，或能阶间的跨越能阶间的跨越，成对电子中，成对电子中的一个的一个电子自旋方向倒转电子自

5、旋方向倒转，使两个电子自旋，使两个电子自旋方向相同而不配对，这时方向相同而不配对，这时s=1，M=3，这种，这种电子激发态称三重电子激发态（三重态）。电子激发态称三重电子激发态（三重态）。分子的激发态分子的激发态 激发态激发态三重电子激发态三重电子激发态s=1，M=3去活化过程及荧光的产生去活化过程及荧光的产生物质分子处于基态最低振动能级物质分子处于基态最低振动能级紫外光照射，吸收两个紫外光照射，吸收两个能级之差的能量能级之差的能量跃迁至跃迁至单重电子激发态单重电子激发态的多个能级的多个能级由于分子之间的振动与撞击，由于分子之间的振动与撞击， 能能量降至量降至第一激发态最低振动能级第一激发态最

6、低振动能级。无辐射跃迁无辐射跃迁去活过程及荧光的产生去活过程及荧光的产生 激发态较高能级激发态较高能级 激发态较高能级激发态较高能级 激发态最低能级激发态最低能级 基态各能级基态各能级 能量以热的能量以热的形式释放形式释放（无辐射迁）（无辐射迁）能量以光量能量以光量子形式释放子形式释放发射荧光发射荧光去活化过程去活化过程 处于激发态各不同振动能级的分子处于激发态各不同振动能级的分子 无辐射跃迁无辐射跃迁 去活化过程去活化过程 激发态最低振动能级激发态最低振动能级基态基态（荧光）（荧光）磷光的产生磷光的产生单重电子激发态分子单重电子激发态分子三重电子激发态三重电子激发态体系跨越（无辐射跃迁）体系

7、跨越（无辐射跃迁）第一电子三重激发态第一电子三重激发态无辐射跃迁无辐射跃迁降至基态降至基态光辐射，发射磷光光辐射，发射磷光荧光和磷光的区别荧光和磷光的区别荧光荧光磷光磷光产生产生S S1 1* * 最低振动能最低振动能级级 基态基态三重态最低振动三重态最低振动能级能级 基态基态波长波长较短较短较长较长寿命寿命10-8 S10-4 几秒几秒几率几率较大较大少见少见 2. 激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱 激发光谱激发光谱：将激发光的光源用单色器分光，测定：将激发光的光源用单色器分光，测定不同波长照射下所发射的荧光强度（不同波长照射下所发射的荧光强度（F F），以），以F F做做纵坐标，激发光

8、波长纵坐标，激发光波长做横坐标作图。做横坐标作图。 激发光谱反映了激发光波长与荧光强度之间的关激发光谱反映了激发光波长与荧光强度之间的关系。系。FA吸收光谱吸收光谱2. 激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱 发射光谱发射光谱：固定激发光波长，让物质发射的荧：固定激发光波长，让物质发射的荧 光通过单色器，测定不同波长的荧光强度，以光通过单色器，测定不同波长的荧光强度，以荧光强度荧光强度F F做纵坐标，荧光波长做纵坐标，荧光波长做横坐标作图。做横坐标作图。 荧光光谱反映了发射的荧光波长与荧光强度的荧光光谱反映了发射的荧光波长与荧光强度的关系。关系。F荧光（发射）光谱的特性荧光（发射）光谱的特性（1

9、 1）stokes位移位移（2）荧光光谱的荧光光谱的形状形状与与激发光波长无关激发光波长无关，不同波长激发光只对不同波长激发光只对荧光强度荧光强度有影响。有影响。（3 3）镜像规则）镜像规则 荧光光谱与吸收光谱呈镜荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称。像对称。吸收峰吸收峰荧光峰荧光峰磷光峰磷光峰图示图示 3. 荧光和分子结构的关系荧光和分子结构的关系 发射荧光的物质应同时具备以下两个条件：发射荧光的物质应同时具备以下两个条件： 物质分子必须具有能够吸收紫外或可见光的物质分子必须具有能够吸收紫外或可见光的 结构，并且能产生结构，并且能产生 * * 或或 n n * * 跃迁。跃迁。 荧光物质必须有较大的

10、荧光物质必须有较大的荧光量子产率荧光量子产率。 3. 荧光和分子结构的关系荧光和分子结构的关系荧光量子产率荧光量子产率（ ）=发射荧光量子数发射荧光量子数 吸收激发光量子数吸收激发光量子数 在在0.1 1之间之间= If/Ia3. 荧光和物质分子结构的关系荧光和物质分子结构的关系（1 1）跃迁类型）跃迁类型 * * 较较 n n * * 跃迁的荧光效率高。跃迁的荧光效率高。 （2 2）共轭结构）共轭结构 凡是能提高凡是能提高电子共轭度的结构，都会电子共轭度的结构，都会 增大荧光强度，并使荧光光谱长移。增大荧光强度，并使荧光光谱长移。苯萘蒽 ：0.11 0.29 0.463. 荧光和分子结构的关

11、系荧光和分子结构的关系（3 3）刚性平面：分子的刚性及共平面性越）刚性平面：分子的刚性及共平面性越大，荧光量子产率就越大。大，荧光量子产率就越大。ocoo-oo-coo-oo-荧光素：氧桥把两个环固荧光素：氧桥把两个环固定在一个平面上，具有平定在一个平面上，具有平面结构，强荧光物质面结构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两个环固酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很好的共平面，定，不能很好的共平面，为非荧光物质为非荧光物质3. 荧光和分子结构的关系荧光和分子结构的关系（4 4）取代基效应：在芳香化合物的芳香环上，进行）取代基效应：在芳香化合物的芳香环上，进行不同基团的取代，对该化合物的荧光强度和荧光光不同基

12、团的取代，对该化合物的荧光强度和荧光光谱都会产生影响。谱都会产生影响。n增强荧光的取代基增强荧光的取代基 -OH -OH、-OR-OR、-NH-NH2 2、 -NHR-NHR、-NR-NR2 2等给电子基团；等给电子基团；n减弱荧光的取代基减弱荧光的取代基 COOH COOH 、-NO-NO2 2 、-COOR -COOR 、-NO-NO、-SH -SH 吸电子基团；吸电子基团； 小结：荧光、磷光的产生小结：荧光、磷光的产生 体系跨越体系跨越基态基态 单重激发态单重激发态三重态三重态荧光荧光磷光磷光预预 习：习： 溶液的荧光强度（溶液的荧光强度（P93） 荧光光谱仪（荧光光谱仪（P95） 分子

13、荧光分析法的应用（分子荧光分析法的应用（P97）复复 习习 荧光、磷光的产生荧光、磷光的产生 激发光谱、发射光谱激发光谱、发射光谱 化合物分子结构与荧光的关系化合物分子结构与荧光的关系本次课内容本次课内容影响荧光强度的因素及溶液荧光的猝影响荧光强度的因素及溶液荧光的猝灭灭（P9395）荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系(P93)荧光分光光度计荧光分光光度计(P95)分子荧光分析法的应用分子荧光分析法的应用(P97)1. 影响荧光强度的因素（影响荧光强度的因素（P93）(1) 溶剂溶剂一般溶剂效应一般溶剂效应特殊溶剂效应特殊溶剂效应溶剂极性的影响溶剂极性的影响n * * * *1.

14、 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素 (2) 温度温度 温度升高温度升高 分子间碰撞增加分子间碰撞增加 分子内能转化加速分子内能转化加速 荧光强度降低荧光强度降低 温度下降温度下降 介质粘度增大介质粘度增大 分子间碰撞减分子间碰撞减 少少 荧光强度增强荧光强度增强1. 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素(3) p pH H值的影响值的影响 当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液p pH H值对该物质荧光强度有较大影响。值对该物质荧光强度有较大影响。OHO_OHH+_pH1有荧光有荧光pH13无荧光无荧光例：苯酚例：苯酚离子化后，离子化后，荧光消失荧光消失1.

15、影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素(4) 内滤光作用和自吸收现象内滤光作用和自吸收现象 内滤光作用：溶液中若存在能吸收内滤光作用：溶液中若存在能吸收激发光激发光或或荧光体所发射荧光体所发射荧光荧光的物质，会使荧光减弱的的物质，会使荧光减弱的现象。现象。自吸收现象：荧光物质的荧光发射光谱短波自吸收现象：荧光物质的荧光发射光谱短波长一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有长一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠，在溶液浓度较大时，一部分荧光被自重叠，在溶液浓度较大时，一部分荧光被自身吸收。身吸收。 1. 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素散射光：当一束平行光投射在液体样品上，大散射光：当一束平行

16、光投射在液体样品上，大部分光线透过溶液，小部分由于光子和物质分部分光线透过溶液，小部分由于光子和物质分子碰撞，使光子运动方向发生改变而向不同角子碰撞，使光子运动方向发生改变而向不同角度散射，这种光称散射光度散射，这种光称散射光( scattering light )。(5) (5) 散射光的影响：应注意散射光的影响：应注意RamanRaman光的干扰光的干扰散射光的影响散射光的影响 瑞利散射光（瑞利散射光（Rayleigh Scattering light）：）： 光子和物质分子碰撞时，未发生能量的光子和物质分子碰撞时，未发生能量的 交换，仅光子运动方向发生改变。交换，仅光子运动方向发生改变。

17、 拉曼散射光（拉曼散射光（Raman Scattering light）：）： 在光子运动方向发生改变的同时，光子在光子运动方向发生改变的同时，光子 将部分能量转给物质分子，或从物质分将部分能量转给物质分子，或从物质分 子得到能量，物质分子的能量会发生改变。子得到能量，物质分子的能量会发生改变。 散射光的影响散射光的影响 拉曼散射光的波长接近荧光波长，拉曼散射光的波长接近荧光波长，在测定时，荧光光谱会与这一散射光有在测定时，荧光光谱会与这一散射光有部分重叠，干扰较大。可通过选用适当部分重叠，干扰较大。可通过选用适当激发光波长的方法予以消除。激发光波长的方法予以消除。2. 溶液荧光的猝灭溶液荧光

18、的猝灭 (P95)n荧光猝灭剂的影响荧光猝灭剂的影响 荧光猝灭：指荧光物质分子与溶剂分子荧光猝灭：指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。现象。常见荧光猝灭类型常见荧光猝灭类型（1 1）碰撞猝灭）碰撞猝灭：猝灭剂分子与处于激发态的荧光：猝灭剂分子与处于激发态的荧光物质分子碰撞而损失能量。物质分子碰撞而损失能量。（2 2）静态猝灭）静态猝灭：部分荧光分子与熄灭剂分子作用：部分荧光分子与熄灭剂分子作用生成了非荧光的配合物。生成了非荧光的配合物。（3 3）转入三重态的猝灭）转

19、入三重态的猝灭：在荧光物质分子中有溶：在荧光物质分子中有溶解氧的存在或引入溴或碘后，易发生体系跨越而解氧的存在或引入溴或碘后，易发生体系跨越而转变成三重态。转变成三重态。常见荧光猝灭类型常见荧光猝灭类型（4 4）发生电荷转移反应的猝灭）发生电荷转移反应的猝灭：（5 5）荧光物质的自猝灭：）荧光物质的自猝灭：单重激发态分子和未单重激发态分子和未激发的荧光物质分子碰撞引起自猝灭。荧光物激发的荧光物质分子碰撞引起自猝灭。荧光物质浓度超过质浓度超过 1 1g/L 时，会产生自身猝灭。时，会产生自身猝灭。3.3.荧光强度与溶液浓度的关系（荧光强度与溶液浓度的关系（P93） If = = f f Ia （

20、1 1）I0IIfIac , l3.3.荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系 If =f Ia ，Ia = I0 - I I / I0 = 10-lc I = I0 10-lc Ia = I0 - I0 10-lc = I0（1- 10-lc ） 3.3.荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系 Ia = I0（1 - e - 2.303lc ） e - 2.303lc = 1 - 2.303lc，（l c0.05） Ia = I0 2.303l cIf =f Ia3.3.荧光强度与溶液浓度的关系荧光强度与溶液浓度的关系 If =f Ia = 2.303f I0l c 当当

21、f f、I I0 0、l 固定不变时，固定不变时，If 与与c成正比成正比 If = K c （l c0.05）（2）4. 定量分析方法定量分析方法n标准曲线法标准曲线法定量分析依据：定量分析依据： If = K c以荧光强度为纵坐标，标准溶液浓度为以荧光强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。横坐标绘制标准曲线。4. 定量分析方法定量分析方法n标准对照法标准对照法如果试样数量不多，可用比较法进行测量。如果试样数量不多，可用比较法进行测量。配一标准溶液浓度为配一标准溶液浓度为Cs， Cs与未知液浓度与未知液浓度Cx相近，相近，并在相同条件下测定它们的荧光强度。并在相同条件下测定它们的荧

22、光强度。 Fs F0 = 2.303 f I0 l cs （1） Fx F0= 2.303 f I0 l cx （2） cx = cs （ Fx F0 ）/ （Fs F0）5.1.2 荧光光谱仪光源光源狭缝狭缝激发光单色器激发光单色器狭缝狭缝样本样本表面吸收物质表面吸收物质发射光单色器发射光单色器检测器检测器放大器放大器指示器指示器记录器记录器960960荧光分光光度计荧光分光光度计荧光光谱仪主要部件荧光光谱仪主要部件n 激发光源激发光源 要求：发光强度大，适用波长范围宽。要求：发光强度大，适用波长范围宽。 常用：高压氙灯、高压汞灯、激光光源。常用：高压氙灯、高压汞灯、激光光源。n 滤光片和单

23、色器滤光片和单色器 在荧光分光光度计中，采用光栅做单色器，在荧光分光光度计中，采用光栅做单色器， 当样品中有杂质荧光或散射光干扰，可采用当样品中有杂质荧光或散射光干扰，可采用适当的滤光片将其滤除。适当的滤光片将其滤除。荧光光谱仪主要部件荧光光谱仪主要部件n检测器：检测器： 光电管或光电倍增管。光电管或光电倍增管。n样品池样品池 石英样品池石英样品池荧光分析法的特点荧光分析法的特点优点：优点：灵敏度高灵敏度高（提高激发光强度，可提高荧光提高激发光强度，可提高荧光强度强度），达），达 ng/ml ；选择性强（选择性强（比较容易排除比较容易排除其它物质的干扰其它物质的干扰），重现性好；取样少。），重

24、现性好；取样少。缺点：缺点：许多物质本身不能发射荧光，因此，应用许多物质本身不能发射荧光，因此，应用不够广泛。不够广泛。5.1.3 分子荧光分析法的应用分子荧光分析法的应用 荧光分析法与荧光分析法与UV-Vis法的比较法的比较 相同点：相同点：都需要吸收紫外都需要吸收紫外- -可见光，产生电可见光，产生电子能级跃迁。子能级跃迁。 荧光法与荧光法与UV-Vis法的比较法的比较 不同点：不同点：n 荧光法测定的是物质经紫外荧光法测定的是物质经紫外- -可见光照可见光照 射后发射出的射后发射出的荧光荧光的强度的强度 (F); ;n UV-Vis法测定的是物质对紫外法测定的是物质对紫外- -可见光可见

25、光的吸收程度的吸收程度 ( (A) ) ; ;n 荧光法定量测定的灵敏度比荧光法定量测定的灵敏度比UV-Vis法高。法高。分子荧光分析法的应用分子荧光分析法的应用定性分析：因物质结构不同，吸收紫定性分析：因物质结构不同，吸收紫 外光波长也不同。外光波长也不同。定量测定：同一种物质的定量测定：同一种物质的稀溶液稀溶液， 浓度大的发射的荧光较强。浓度大的发射的荧光较强。有机化合物的分析有机化合物的分析 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活性的荧光；可直接用荧光法测定。对于具有致癌活性的多环芳烃多环芳烃荧光分

26、析法是最主要的测定方法；荧光分析法是最主要的测定方法； 脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，自身能发脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，自身能发荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光的很少，一般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析；荧光分析； 可测定结构复杂的大量有机物质，如：各种维生素、可测定结构复杂的大量有机物质，如：各种维生素、叶绿素、氨基酸、蛋白质、酶和辅酶以及各种药物、叶绿素、氨基酸、蛋白质、酶和辅酶以及各种药物、毒物和农药等。毒物和农药等。无机化合物的分析无机化合物的分析 无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定的为无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定的为数不多，但能与有机化合物生成有荧光的配合物后数不多，但能与有机化合物生成有荧光的配合物后进行荧光分析的元素达进行荧光分析的元素达2020多种，其中较常采用荧光多种，其中较常采用荧光法测定的元素有：法测