第04章-免疫组化技术-2

1、 第四节第四节 亲和免疫组织化学技术亲和免疫组织化学技术n 20世纪世纪70年代以来，随着免疫组织化学技术的广泛应用，年代以来，随着免疫组织化学技术的广泛应用，一些具有双价或多价结合力的物质如生物素、植物凝集素和一些具有双价或多价结合力的物质如生物素、植物凝集素和葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A（SPA）等被应用于免疫组织化学技术。这）等被应用于免疫组织化学技术。这些方法的特点是以一种物质对某种组织成分具有高度亲和力些方法的特点是以一种物质对某种组织成分具有高度亲和力为基础，为基础，1976年年Bayer首次称之为亲和组织化学。实际上，首次称之为亲和组织化学。实际上，抗原抗体反应本质上也属于亲和组织

2、化学的范畴。目前，亲抗原抗体反应本质上也属于亲和组织化学的范畴。目前，亲和组织化学包括抗原与抗体，生物素与抗生物素，植物凝集和组织化学包括抗原与抗体，生物素与抗生物素，植物凝集素和糖类，葡萄球菌蛋白素和糖类，葡萄球菌蛋白A与与IgG，阳离子与阴离子，激素、，阳离子与阴离子，激素、维生素、糖及类脂质作用部位和受体等。维生素、糖及类脂质作用部位和受体等。 一、生物素一、生物素-抗生物素免疫组织化学技术抗生物素免疫组织化学技术 （一）基本原理（一）基本原理 鸡蛋中含有一种碱性蛋白，属于糖蛋白，也称卵白素鸡蛋中含有一种碱性蛋白，属于糖蛋白，也称卵白素（avidin），分子量），分子量68000。卵白素

3、具有卵白素具有4个与维生素个与维生素H或称或称生物素（生物素（biotin）亲和力极高的结合位点）亲和力极高的结合位点。生物素是一种小。生物素是一种小分子维生素，分子量分子维生素，分子量244，它与卵白素之间的亲和力比抗原，它与卵白素之间的亲和力比抗原抗体之间的亲和力高抗体之间的亲和力高100万倍，因而能彼此牢固缔结和而不万倍，因而能彼此牢固缔结和而不影响各自的生物活性。同时，生物素与卵白素都具有与其他影响各自的生物活性。同时，生物素与卵白素都具有与其他标记物如荧光素、铁蛋白和过氧化酶等结合的能力。目前，标记物如荧光素、铁蛋白和过氧化酶等结合的能力。目前，已利用上述特性建立了卵白素已利用上述特

4、性建立了卵白素-生物素免疫染色系统，为了便生物素免疫染色系统，为了便于理解，现在统称卵白素为抗生物素或亲和素，因此，卵白于理解，现在统称卵白素为抗生物素或亲和素，因此，卵白素素-生物素免疫染色系统又称为生物素生物素免疫染色系统又称为生物素-抗生物素免疫组织化抗生物素免疫组织化学技术学技术 （1）石蜡切片脱蜡至水，用）石蜡切片脱蜡至水，用0.01mol/L PBS（pH=7.4）漂洗）漂洗5min3次；次； （2）滴加）滴加0.3% H2O2，37孵育孵育10min，阻断内源性，阻断内源性过氧化物酶；过氧化物酶； （3）用）用0.01 mol/L PBS漂洗漂洗5min3次；次； （4）滴加）滴

5、加10%正常血清正常血清/0.3%Triton X-100/0.01 mol/L PBS，37孵育孵育10 min； （5）滴加抗小鼠）滴加抗小鼠单克隆抗体（一抗单克隆抗体（一抗）37 1 h或或4过夜，过夜，PBS漂洗漂洗5min3次；次； （6）加）加生物素标记二抗生物素标记二抗（效价（效价1:200），室温孵育），室温孵育10 min，PBS漂洗漂洗5min3次；次； （7）滴加）滴加链霉素抗生物素蛋白链霉素抗生物素蛋白-HRP液液，室温孵育，室温孵育10min；PBS洗洗5min3次；次； （8）滴加滴加DAB，显微镜下显色，显微镜下显色510min （二）（二）ABC免疫组织化学技术

6、免疫组织化学技术 1981年，许世明等建立了年，许世明等建立了抗生物素抗生物素-生物素生物素-过过氧化物酶法氧化物酶法（avidin-biotin-peroxidase complex method，简称，简称ABC法）。法）。ABC是卵白素是卵白素-生物素结合生物素结合的的HRP复合物的简称。复合物的简称。ABC复合物是先将复合物是先将HRP与生物与生物素结合，然后按一定比例将此复合物与卵白素反应，素结合，然后按一定比例将此复合物与卵白素反应，使使每一个卵白素分子上结合每一个卵白素分子上结合3个带个带HRP的生物素，留出的生物素，留出一个能与其它生物素结合的空位一个能与其它生物素结合的空位。

7、复合物上携带的。复合物上携带的HRP越多，则酶催化的组织化学反应也越强烈，阳性越多，则酶催化的组织化学反应也越强烈，阳性结果也越明显结果也越明显 （三）（三）SABC免疫组织化学技术免疫组织化学技术 链霉亲和素是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白链霉亲和素是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白质，分子量质，分子量60000， 含糖链。链霉亲和素也有四个生含糖链。链霉亲和素也有四个生物素亲合位点，是一种更理想的抗生物素结合蛋白。物素亲合位点，是一种更理想的抗生物素结合蛋白。SABC是链霉亲和素是链霉亲和素-生物素生物素-HRP复合物（复合物（strept-avidin-biotin-peroxidase

8、complex）的简称）的简称。SABC复合物先将复合物先将HRP与生物素结合，然后按一定比例将此与生物素结合，然后按一定比例将此复合物与链霉亲和素反应，使每一个链霉亲和素分子复合物与链霉亲和素反应，使每一个链霉亲和素分子上结合上结合3个带个带HRP的生物素，留出一个尚未被生物素结的生物素，留出一个尚未被生物素结合的空位，可以与各种生物素标记的抗体结合。复合合的空位，可以与各种生物素标记的抗体结合。复合物上携带的物上携带的HRP越多，则酶催化的组织化学反应也越越多，则酶催化的组织化学反应也越强烈，阳性结果也越明显强烈，阳性结果也越明显 n SABC SABC法是在一抗体反应后，用已结合生物素的

9、抗法是在一抗体反应后，用已结合生物素的抗IgGIgG抗体二抗桥接。然后用抗体二抗桥接。然后用SABCSABC孵育，使桥抗上的生物素与孵育，使桥抗上的生物素与SABCSABC中链霉亲和素上的空位结合。最后仍用中链霉亲和素上的空位结合。最后仍用HRPHRP的底物成的底物成色。在色。在SABCSABC法中，法中，一抗是特异性的一抗是特异性的，二抗是生物素标记二抗是生物素标记的二抗，三抗是的二抗，三抗是SABCSABC复合物复合物。SABCSABC复合物与桥抗体之间复合物与桥抗体之间是通过生物素结合的，因此是通过生物素结合的，因此SABCSABC复合物没有种属特异性，复合物没有种属特异性，可适用于任何

10、种属的一抗。可适用于任何种属的一抗。n 当然，生物素结合的二抗必须是针对一抗种属的。因当然，生物素结合的二抗必须是针对一抗种属的。因此，此，SABCSABC法较法较PAPPAP法操作更简单、更灵敏。目前，法操作更简单、更灵敏。目前，SABCSABC试试剂盒已经商品化，可以根据需要购买。剂盒已经商品化，可以根据需要购买。 （四）（四）PAP法与法与ABC法联合（法联合（ABPAP）技术）技术n ABPAP ABPAP使特异性一抗结合更多的酶分子，原始信号得使特异性一抗结合更多的酶分子，原始信号得 到更大的放大效应。到更大的放大效应。n （1 1）石蜡切片脱蜡至水）石蜡切片脱蜡至水 n （2 2）

11、滴加）滴加0.3% H0.3% H2 2O O2 2，80%80%甲醇抑制内源性过氧化物酶甲醇抑制内源性过氧化物酶n （3 3）用）用0.1 0.1 胰蛋白酶室温消化胰蛋白酶室温消化10min10minn （4 4）滴加二抗的正常血清）滴加二抗的正常血清1:101:10；n （5 5）滴加适当稀释的一抗；）滴加适当稀释的一抗；n （6 6）加适当稀释的标记二抗；）加适当稀释的标记二抗； n（7 7）滴加鼠）滴加鼠PAPPAP或兔或兔PAPPAP；n（8 8）生物素化马抗鼠或羊抗兔；）生物素化马抗鼠或羊抗兔；n（9 9）滴加）滴加ABCABC复合物；复合物；n（1010）滴加）滴加0.04% D

12、AB + 0.03% 0.04% DAB + 0.03% H H2 2O O2 2，n（1111）蒸馏水漂洗，苏木精复染（必要时），脱水、透）蒸馏水漂洗，苏木精复染（必要时），脱水、透明、封片、观察。明、封片、观察。n 评价评价 ABPAPABPAP法较单一法较单一PAPPAP法和法和ABCABC法更为敏感，法更为敏感，抗体稀释度大大提高，尤其是对抗原性较弱、容易破坏或抗体稀释度大大提高，尤其是对抗原性较弱、容易破坏或丢失的抗原，能得到较好的效果。但丢失的抗原，能得到较好的效果。但ABPAPABPAP法较单一法较单一PAPPAP法法和和ABCABC法步骤增多、操作复杂，背景着色会相应加深，而法

13、步骤增多、操作复杂，背景着色会相应加深，而且容易脱片。且容易脱片。 二、葡萄球菌蛋白二、葡萄球菌蛋白A A（SPASPA）免疫组织化学技术）免疫组织化学技术 （一）（一）SPASPA的生物学特性的生物学特性 1 1生化特性生化特性 葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A A是一种从金黄色葡是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，简称蛋白萄球菌细胞壁分离的蛋白质，简称蛋白A A（SPASPA）。）。SPASPA存在于大部分（存在于大部分（90%90%）金葡菌，并且主要存在于血浆凝）金葡菌，并且主要存在于血浆凝固酶阳性的菌株。内含固酶阳性的菌株。内含3 3个高度相似的个高度相似的FcFc段结合区，每段结合区

14、，每区有区有5050个以上的氨基酸组成，不含色氨酸和半胱氨酸。个以上的氨基酸组成，不含色氨酸和半胱氨酸。SPASPA的羧基末端是赖氨酸，氨基末端结构尚未肯定，其的羧基末端是赖氨酸，氨基末端结构尚未肯定，其黏度高于球蛋白，等电点黏度高于球蛋白，等电点PI=5.1PI=5.1，天然结构十分稳定，天然结构十分稳定，在应用在应用6mol/L6mol/L鸟嘌呤盐酸盐变性剂条件下，尚能保存某鸟嘌呤盐酸盐变性剂条件下，尚能保存某些三级结构，除去变性剂后，能自然矫正恢复原有结构。些三级结构，除去变性剂后，能自然矫正恢复原有结构。 2免疫学特性免疫学特性 SPA具有与人和许多动物如豚鼠、具有与人和许多动物如豚鼠

15、、猪、小鼠、猴等猪、小鼠、猴等IgG结合的能力。结合的能力。SPA结合部位是结合部位是Fc段段而不是而不是Fab段，结合后不影响抗体的活性。段，结合后不影响抗体的活性。SPA具有双具有双价结合力，价结合力，每分子每分子SPA可同时结合两个可同时结合两个IgG分子，也可分子，也可一方面与一方面与IgG结合，同时与标记物结合，同时与标记物（如荧光素）结合。（如荧光素）结合。另外，与另外，与SPA结合后的结合后的IgG可用可用4mol/L鸟嘌呤盐酸盐使鸟嘌呤盐酸盐使其解离。其解离。 3其他特性其他特性 SPA能引起豚鼠离体回肠的收缩，能引起豚鼠离体回肠的收缩，在吞噬反应中抑制在吞噬反应中抑制IgG调

16、理素的吞噬和杀菌作用，调理素的吞噬和杀菌作用，SPA-IgG能固定人的补体和人、狗、猪的新鲜补体等能固定人的补体和人、狗、猪的新鲜补体等 （二）（二）SPA在免疫组织化学中的应用在免疫组织化学中的应用 目前，目前，SPA已广泛应用于免疫球蛋白的制备和已广泛应用于免疫球蛋白的制备和分析、免疫组织化学标记、多种病原体（细菌、病毒分析、免疫组织化学标记、多种病原体（细菌、病毒和支原体等）快速诊断，作为研究免疫复合物、膜抗和支原体等）快速诊断，作为研究免疫复合物、膜抗原、膜受体和膜原、膜受体和膜IgG的固相吸附剂。本节主要介绍的固相吸附剂。本节主要介绍SPA在免疫组织化学标记中的应用。在免疫组织化学标

17、记中的应用。SPA可被多种标可被多种标记物如荧光素、过氧化物酶、胶体金和铁蛋白等所标记物如荧光素、过氧化物酶、胶体金和铁蛋白等所标记，记，应用较广的为应用较广的为酶标酶标SPA和金标记和金标记SPA技术技术。标记。标记SPA常用的酶为常用的酶为HRP，SPA在在PAP法中可以代替桥抗法中可以代替桥抗。 1SPA-HRP间接法染色间接法染色 （1）石蜡切片脱蜡后用）石蜡切片脱蜡后用0.5% H2O2-纯甲醇液处理纯甲醇液处理20min，抑制内源性过氧化物酶；抑制内源性过氧化物酶； （2）用）用Tris-HCl 缓冲液洗涤缓冲液洗涤3min2次；次； （3）加一抗血清覆盖切片，）加一抗血清覆盖切片

18、，37孵育孵育30 min； （4）用）用Tris-HCl 缓冲液洗涤缓冲液洗涤5min3次；次； （5）滴加适当稀释的）滴加适当稀释的SPA-HRP，室温处理室温处理30min； （6）用）用Tris-HCl 缓冲液洗涤缓冲液洗涤5min3次，次，DAB-H2O2室室温显色，蒸馏水漂洗；温显色，蒸馏水漂洗； （7）苏木精复染，脱水、透明、封片，镜下观察反应）苏木精复染，脱水、透明、封片，镜下观察反应产物呈棕色。产物呈棕色。 2SPA用于用于PAP法染色法染色 （1）石蜡切片脱蜡后用）石蜡切片脱蜡后用0.3% H2O2-80%纯甲醇液抑制纯甲醇液抑制内源性过氧化物酶内源性过氧化物酶20min；

19、 （2）加）加10%卵白蛋白卵白蛋白Tris 缓冲液，室温作用缓冲液，室温作用20min； （3）加一抗血清覆盖切片，）加一抗血清覆盖切片，37孵育孵育45 min （4）用）用Tris-HCl 缓冲液洗涤缓冲液洗涤5min； （5）滴加滴加SPA室温处理室温处理30min， 缓冲液洗涤缓冲液洗涤5min； （6）加加PAP复合物孵育复合物孵育30min， 缓冲液洗涤缓冲液洗涤5min； （7）加）加DAB（0.6mg/ml）和）和0.01% H2O2室温显色室温显色5min，蒸馏水漂洗；，蒸馏水漂洗； （8）苏木精复染）苏木精复染1min，脱水、透明、封片，镜下观察，脱水、透明、封片，镜下观

20、察反应产物呈棕色反应产物呈棕色 三、凝集素免疫组织化学技术三、凝集素免疫组织化学技术 凝集素（凝集素（lectinlectin）是一种从植物、无脊椎动物和高）是一种从植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因能凝集红细胞等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因能凝集红细胞（含血型物质）而得名。常用的有植物凝集素（含血型物质）而得名。常用的有植物凝集素（phytoagglutinphytoagglutin，PNAPNA），通常以其来源植物命名，如刀），通常以其来源植物命名，如刀豆素（豆素（conconvalinaconconvalina，ConAConA）、麦胚素（）、麦胚素（wh

21、eat germ wheat germ agglutininagglutinin，WGAWGA）、花生凝集素（）、花生凝集素（peanut agglutininpeanut agglutinin，PNAPNA）和大豆凝集素（）和大豆凝集素（soybean agglutininsoybean agglutinin，SBASBA）等。凝）等。凝集素不是来源或参与免疫反应的产物，但具有某些集素不是来源或参与免疫反应的产物，但具有某些“亲合亲合”特性，可被免疫组织化学所应用，因此，凝集素免疫组织特性，可被免疫组织化学所应用，因此，凝集素免疫组织化学应称为凝集素组织化学化学应称为凝集素组织化学 （一）凝

22、集素的生物学特性（一）凝集素的生物学特性 生物膜中含有一定的糖类，主要以糖蛋白和糖脂的形生物膜中含有一定的糖类，主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。式存在。凝集素能识别凝集素能识别糖蛋白和糖肽，特别是细胞膜中复糖蛋白和糖肽，特别是细胞膜中复杂的碳水化物结构，即细胞膜表面的杂的碳水化物结构，即细胞膜表面的碳水化物决定簇碳水化物决定簇。一一种凝集素具有对某种特异性糖基专一性结合的能力，种凝集素具有对某种特异性糖基专一性结合的能力，如刀如刀豆素与豆素与-吡喃糖基甘露糖（吡喃糖基甘露糖（-D-mannopyranosyl-D-mannopyranosyl）结合，）结合，麦胚素与麦胚素与N-N-乙酰糖胺（乙酰

23、糖胺（N-acetyl glucosamineN-acetyl glucosamine）结合。因）结合。因此，此，凝集素可以作为探针，研究细胞膜上特定的糖基凝集素可以作为探针，研究细胞膜上特定的糖基。另。另外，外，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、酶、凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，胶体金和铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜或电镜水平显从而在光镜或电镜水平显示其结合部位示其结合部位 （二）凝集素在免疫组织化学中的应用（二）凝集素在免疫组织化学中的应用 由于凝集素的以上生物学特性，目前已广泛应用由于凝集素的以上生物学特性，目前已广泛应用作为细胞分

24、化和成熟的标记、细胞特殊类型标记和肿瘤作为细胞分化和成熟的标记、细胞特殊类型标记和肿瘤细胞凝结素结合特性的研究。凝集素可以被多种标记物细胞凝结素结合特性的研究。凝集素可以被多种标记物如荧光素、过氧化物酶、生物素等所标记，进行免疫组如荧光素、过氧化物酶、生物素等所标记，进行免疫组织化学染色。织化学染色。 1 1直接法直接法 将标记物质直接标记在凝集素上，使将标记物质直接标记在凝集素上，使其直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂结合。本法简便、其直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂结合。本法简便、快速，但灵敏度不高。快速，但灵敏度不高。将荧光、将荧光、HRP或胶体金标记或胶体金标记的凝集素直接的凝集素直接用于未

25、处理组用于未处理组织，简单迅速织，简单迅速但敏感性差。但敏感性差。 2 2间接法间接法 将生物素化的凝集素直接与切片中的相将生物素化的凝集素直接与切片中的相应糖基结合，生物素同应糖基结合，生物素同ABCABC复合物结合。本法简便、快速，复合物结合。本法简便、快速，而且灵敏度高。试剂盒已商品化，可以方便购买。而且灵敏度高。试剂盒已商品化，可以方便购买。 （1 1）石蜡切片常规脱蜡至水，加）石蜡切片常规脱蜡至水，加0.01%0.01%胰蛋白酶消化胰蛋白酶消化20min20min； （2 2）TBSTBS洗涤洗涤5min5min2 2次后，在次后，在10%BSA10%BSA中浸育中浸育5min5mi

26、n，以减少非特异性染色；以减少非特异性染色； （3 3）加与生物素结合的凝集素（）加与生物素结合的凝集素（10g/ml10g/ml），孵育），孵育60min60min，TBSTBS洗涤洗涤5min5min2 2次；次； （4 4）加）加ABCABC浸育浸育60min60min，TBSTBS洗涤洗涤5min5min2 2次；次； （5 5）DABDAB显色，流水洗涤，苏木精复染，脱水、透明、显色，流水洗涤，苏木精复染，脱水、透明、封片。封片。将组织切片孵育于凝集素溶液，使之结合于切片上的糖链，将组织切片孵育于凝集素溶液，使之结合于切片上的糖链，清洗后加凝集素的特异性抗体。该抗体可用清洗后加凝集素

27、的特异性抗体。该抗体可用FITC、HRP或胶体金标记；也可不标记凝集素抗体，而将二抗标记，或胶体金标记；也可不标记凝集素抗体，而将二抗标记，或使用未标记二抗，再用或使用未标记二抗，再用PAP复合物完成染色。复合物完成染色。将凝集素用生物素标记，然后加用标记的抗生物将凝集素用生物素标记，然后加用标记的抗生物素蛋白，或素蛋白，或ABC复合物使之与生物素结合复合物使之与生物素结合 3 3糖糖- -凝集素凝集素- -糖法糖法 利用过量的凝集素与切片中特利用过量的凝集素与切片中特定的糖基结合，经过冲洗后，凝集素上还存在未被占用的定的糖基结合，经过冲洗后，凝集素上还存在未被占用的结合位点，将这些未结合的部

28、位与经过氧化物酶标记的特结合位点，将这些未结合的部位与经过氧化物酶标记的特异性糖基结合，形成一个三明治样的糖异性糖基结合，形成一个三明治样的糖- -凝集素凝集素- -糖复合物。糖复合物。本法特异性强、灵敏度高，既不像本法特异性强、灵敏度高，既不像ABCABC法那样要结合生物法那样要结合生物素，也不需要像素，也不需要像PAPPAP法那样制备抗体。法那样制备抗体。 （1 1）石蜡切片脱蜡后用）石蜡切片脱蜡后用0.3% H0.3% H2 2O O2 2- -纯甲醇液处理纯甲醇液处理20min20min，抑制内源性过氧化物酶；抑制内源性过氧化物酶； （2 2）用凝集素室温孵育）用凝集素室温孵育30mi

29、n 30min ，TBSTBS洗涤洗涤3min3min2 2次；次； （3 3）加）加10g/ml HRP10g/ml HRP标记的糖液，室温孵育标记的糖液，室温孵育30 min30 min，TBSTBS洗涤洗涤5min5min2 2次；次； （4 4）DAB-HDAB-H2 2O O2 2显色，蒸馏水漂洗，脱水、透明、封片。显色，蒸馏水漂洗，脱水、透明、封片。将过量凝集素加于组织切将过量凝集素加于组织切片上（以保证凝集素的结片上（以保证凝集素的结合位点被组织上的糖基不合位点被组织上的糖基不完全占据）再加糖基化的完全占据）再加糖基化的标记物（如岩藻糖基标记物（如岩藻糖基Fuc-HRP)，其中的

30、糖基，其中的糖基将结合于未被占据的凝集将结合于未被占据的凝集素结合位点，然后显示标素结合位点，然后显示标记物。由于目前发现的糖记物。由于目前发现的糖基化的标记物种类不多，基化的标记物种类不多，故夹层发的使用有限。故夹层发的使用有限。 第五节第五节 免疫金银及铁标记技术免疫金银及铁标记技术n 应用胶体金作为标记物的免疫金染色和免疫应用胶体金作为标记物的免疫金染色和免疫金银染色方法，在光镜和电镜下可以进行单标记、金银染色方法，在光镜和电镜下可以进行单标记、双重标记或多重标记，观察组织和细胞结构，定双重标记或多重标记，观察组织和细胞结构，定性、定位和定量研究。性、定位和定量研究。n 一、胶体金的基本

31、概念一、胶体金的基本概念 n 1 1分散体系分散体系 体系是一定空间范围内作为研体系是一定空间范围内作为研究对象的物质，某一种或几种物质分散到另一种物质究对象的物质，某一种或几种物质分散到另一种物质中所组成的体系称为分散体系。被分散的物质称为分中所组成的体系称为分散体系。被分散的物质称为分散相或分散质，而另一种物质称为分散介质。分散体散相或分散质，而另一种物质称为分散介质。分散体系的某些性质因分散相质点的大小而改变，可分为三系的某些性质因分散相质点的大小而改变，可分为三类：类：n （1 1）离子分散体系：分散相以小分子或离子状态）离子分散体系：分散相以小分子或离子状态分散，这种溶液具有高度稳定

32、性，无论放置多久，分分散，这种溶液具有高度稳定性，无论放置多久，分散相颗粒都不会因重力而下沉，不会从容液中分散出散相颗粒都不会因重力而下沉，不会从容液中分散出来来 n （2 2）胶体分散体系：分散相颗粒大小在）胶体分散体系：分散相颗粒大小在1 110nm10nm之间，胶体溶液外观透明不浑浊，普通显微镜之间，胶体溶液外观透明不浑浊，普通显微镜下看不见其分散相粒子，不易受重力影响与分散介下看不见其分散相粒子，不易受重力影响与分散介质分离而沉淀，但其中的溶胶粒子有聚结变大的倾质分离而沉淀，但其中的溶胶粒子有聚结变大的倾向，即具有聚结不稳定性。向，即具有聚结不稳定性。n （3 3）粗分散体系：分散相颗

33、粒由许多分子组成，）粗分散体系：分散相颗粒由许多分子组成，因粒子较大，肉眼或显微镜即可看到，不稳定，极因粒子较大，肉眼或显微镜即可看到，不稳定，极易因重力作用而自动沉降，外观浑浊不透明。易因重力作用而自动沉降，外观浑浊不透明。n 2 2胶体金的一般形状胶体金的一般形状 胶体金也称金溶胶，是胶体金也称金溶胶，是指分散相粒子直径在指分散相粒子直径在l l150nm150nm之间的金溶胶，是由金之间的金溶胶，是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液，具有一般溶胶盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液，具有一般溶胶的特性。属于多相不均匀体系，颜色呈桔红色到紫红的特性。属于多相不均匀体系，颜色呈桔红色到紫红色（

34、颗粒越大，颜色越深）。色（颗粒越大，颜色越深）。n 胶体金可以作为标记物用于免疫组织化学，近胶体金可以作为标记物用于免疫组织化学，近1010多年来胶体金标记已经发展为一项重要的免疫标记技多年来胶体金标记已经发展为一项重要的免疫标记技术。胶体金免疫分析在药物检测、生物医学等许多领术。胶体金免疫分析在药物检测、生物医学等许多领域的研究已经得到发展，并越来越受到相关研究领域域的研究已经得到发展，并越来越受到相关研究领域的重视的重视n 3. 胶体金标记蛋白胶体金标记蛋白n 溶液的溶液的pHpH等于或稍高于蛋白质等电点时，蛋白质呈等于或稍高于蛋白质等电点时，蛋白质呈中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒之间的

35、静电作用较中性，此时蛋白质分子与胶体金颗粒之间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力最大，处于一种微弱的水小，但蛋白质分子的表面张力最大，处于一种微弱的水化状态，易于吸附于金颗粒的表面。由于蛋白质分子牢化状态，易于吸附于金颗粒的表面。由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶固地结合在金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒间的相互接触，使胶体金溶液处于稳定状态。体金颗粒间的相互接触，使胶体金溶液处于稳定状态。为防止蛋白质与胶体金的聚合与沉淀，常用牛血清白蛋为防止蛋白质与胶体金的聚合与沉淀，常用牛血清白蛋白、卵蛋白、聚乙二醇或明胶做稳定剂。白、卵蛋白、聚乙二醇或明胶

36、做稳定剂。n 二、免疫金银组织化学技术二、免疫金银组织化学技术n （一）免疫金染色（一）免疫金染色n 1 1免疫金法免疫金法 免疫金法（免疫金法（IGSIGS）染色程序简）染色程序简单，无需显色就能检测细胞表面的抗原，又能检单，无需显色就能检测细胞表面的抗原，又能检测细胞内抗原。阳性部位显红色，一般要求胶体测细胞内抗原。阳性部位显红色，一般要求胶体金颗粒直径大于金颗粒直径大于20nm20nm，浓度较高。分为直接法，浓度较高。分为直接法（标记一抗）和间接法。用（标记一抗）和间接法。用IGSIGS定位细胞抗原一般定位细胞抗原一般采用间接法。采用间接法。n （二）免疫金银法（二）免疫金银法n 免疫金

37、银法（免疫金银法（IGSSIGSS）的基本原理是通过免疫反应沉）的基本原理是通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子（苯二酚还原剂将银离子（Ag+Ag+）还原成银原子（）还原成银原子（AgoAgo）。）。被还原的银原子围绕金颗粒形成一个被还原的银原子围绕金颗粒形成一个“银壳银壳”，“银壳银壳”一旦形成本身也具有催化作用，从而使更多银离子还原，一旦形成本身也具有催化作用，从而使更多银离子还原，促使促使“银壳银壳”越来越大，最终抗原位置清楚放大。越来越大，最终抗原位置清楚放大。n IGSSIGSS优点：用于光

38、镜和电镜观察；敏感性高；优点：用于光镜和电镜观察；敏感性高；定位准确；方法简便、安全；成本较低，标本可定位准确；方法简便、安全；成本较低，标本可长期保存长期保存n （三）彩色免疫金银法（三）彩色免疫金银法（CIGSSCIGSS） 是在是在IGSSIGSS基基础上发展起来的，基本原理与彩色显影相似。础上发展起来的，基本原理与彩色显影相似。IGSSIGSS方方法在抗原位点处生成银颗粒，经铁氰化钾与溴化钾的法在抗原位点处生成银颗粒，经铁氰化钾与溴化钾的作用即被氧化成溴化银，后者与彩色显影剂接触后即作用即被氧化成溴化银，后者与彩色显影剂接触后即被还原成金属银，而彩色显影剂本身则被氧化，其氧被还原成金属

39、银，而彩色显影剂本身则被氧化，其氧化产物使彩色呈色剂由无色变成有色染料，沉积在银化产物使彩色呈色剂由无色变成有色染料，沉积在银颗粒的部位，金属银变成了银离子。由于染料只能通颗粒的部位，金属银变成了银离子。由于染料只能通过彩色显影剂沉积在有银的部位，所以，不与组织发过彩色显影剂沉积在有银的部位，所以，不与组织发生非特异性吸附。生非特异性吸附。 （四）免疫金银组织化学技术的优点（四）免疫金银组织化学技术的优点1.1.胶体金制备简单胶体金制备简单2.2.标记简单，抗体生物活性不受影响标记简单，抗体生物活性不受影响3.3.特异性强特异性强4.4.敏感性高敏感性高5.5.定位准确定位准确6.6.适应性广

40、适应性广7.7.易于多重双重标记易于多重双重标记n 三、免疫胶体铁组织化学技术三、免疫胶体铁组织化学技术n 胶体铁（胶体铁（ferric colloidferric colloid）是一种阳离子胶体，）是一种阳离子胶体，可以通过普鲁士蓝反应呈色，其颗粒有一定的大小和可以通过普鲁士蓝反应呈色，其颗粒有一定的大小和电子密度，最初用于光镜和电镜下定位组织中的阴离电子密度，最初用于光镜和电镜下定位组织中的阴离子部位，后来用于标记抗体分子，应用于免疫组织化子部位，后来用于标记抗体分子，应用于免疫组织化学技术。本法特异性强、敏感性高、背景清晰。学技术。本法特异性强、敏感性高、背景清晰。n 目前常用水合联胺

41、目前常用水合联胺-二甲砷酸二甲砷酸-FeCl3煮沸法制备微煮沸法制备微细颗粒的胶体铁，该方法制备的胶体铁呈棕红色，颗细颗粒的胶体铁，该方法制备的胶体铁呈棕红色，颗粒大小粒大小1nm左右左右 。n 光镜下，阳性部位呈蓝色，细胞核呈红色光镜下，阳性部位呈蓝色，细胞核呈红色 第六节第六节 免疫组化双标技术免疫组化双标技术 应用免疫细胞化学方法在同一张组织、细胞片上，同时应用免疫细胞化学方法在同一张组织、细胞片上，同时或先后显示两种或两种以上的抗原成分，称为免疫双重或多重或先后显示两种或两种以上的抗原成分，称为免疫双重或多重标记技术。标记技术。光镜下可通过标记物或其反应生成物的颜色来标记光镜下可通过标

42、记物或其反应生成物的颜色来标记不同的抗原成分，电镜下则可通过标记物颗粒的大小来表示不不同的抗原成分，电镜下则可通过标记物颗粒的大小来表示不同的抗原成分。本章主要介绍光镜免疫双重或多重标记技术同的抗原成分。本章主要介绍光镜免疫双重或多重标记技术。 一、基本原理和方法一、基本原理和方法 目前已建立了许多方法，根据其作用方式和原理的不同，目前已建立了许多方法，根据其作用方式和原理的不同，可以分为洗脱法和非洗脱法两大类。可以分为洗脱法和非洗脱法两大类。 （一）洗脱法（一）洗脱法 一般用于光镜下间接法所做的双标。一般用于光镜下间接法所做的双标。基本原理基本原理是在是在第一种染色完成后，用第一种染色完成后

43、，用酸性溶液洗脱酸性溶液洗脱这种染色在切片上这种染色在切片上形成的抗原抗体复合物，从而避免与下一种抗体系统发形成的抗原抗体复合物，从而避免与下一种抗体系统发生交叉反应。按洗脱效果，可以分为以下两种情况。生交叉反应。按洗脱效果，可以分为以下两种情况。 1洗脱第一种染色中的抗原抗体复合物，但保留洗脱第一种染色中的抗原抗体复合物，但保留显色反应的生成物显色反应的生成物，然后做下一种染色，并采用不同颜，然后做下一种染色，并采用不同颜色的反应生成物来标示第二种抗原。这样，色的反应生成物来标示第二种抗原。这样，两种颜色可两种颜色可同时并存于同一组织片上同时并存于同一组织片上显示两种抗原。显示两种抗原。 2

44、洗脱第一种染色中的抗原抗体复合物及显色反洗脱第一种染色中的抗原抗体复合物及显色反应生成物，再做下一种染色。应生成物，再做下一种染色。这时第二种染色实际上是在这时第二种染色实际上是在回复为空白的组织片上重新进行，并用不同颜色的反应生回复为空白的组织片上重新进行，并用不同颜色的反应生成物与前一种结果相区别。这种方法得到的成物与前一种结果相区别。这种方法得到的两种染色阳性两种染色阳性结果是先后而不是同时并存在同一组织片上结果是先后而不是同时并存在同一组织片上。要比较和了。要比较和了解它们之间的关系，必须在完成第一种染色后先拍照，然解它们之间的关系，必须在完成第一种染色后先拍照，然后在第二种染色后找到

45、同一区域再次拍照，比较两次照片后在第二种染色后找到同一区域再次拍照，比较两次照片的结果。的结果。 （二）非洗脱法二）非洗脱法 在染色过程中，在染色过程中，不用洗脱不用洗脱第一种染色的抗原第一种染色的抗原抗体复合物及显色反应产物，而用多种不同的技抗体复合物及显色反应产物，而用多种不同的技术方法来避免与第二种染色抗体系统的交叉反应，术方法来避免与第二种染色抗体系统的交叉反应，即非洗脱法。较常用的非洗脱法有以下几种。即非洗脱法。较常用的非洗脱法有以下几种。 1直接法直接法 把把不同颜色的标记物不同颜色的标记物分别分别标记到标记到各个特异性抗体（一抗）各个特异性抗体（一抗）上，采用直接法染色，上，采用

46、直接法染色，特异性抗体分别与相应的抗原结合，使抗原由不特异性抗体分别与相应的抗原结合，使抗原由不同的标记物显示出来，实现双标或多标（图同的标记物显示出来，实现双标或多标（图6-16-1）。）。 图图6-1 直接法免疫双重染色原理直接法免疫双重染色原理X X、Y Y为两种抗原为两种抗原 HRPHRP为辣根过氧化物酶为辣根过氧化物酶 APAP为碱性磷酸酶为碱性磷酸酶 2间接法间接法-异种动物抗体法异种动物抗体法 不同种动物不同种动物IgG的的Fc段抗原有种属特异性，因此相应的抗体段抗原有种属特异性，因此相应的抗体不会发生交叉反应。用间接法染色时，不会发生交叉反应。用间接法染色时，不同的一不同的一抗

47、（如兔抗抗（如兔抗X抗原的抗体和豚鼠抗抗原的抗体和豚鼠抗Y抗原的抗体）抗原的抗体）可混合在一起使用，可混合在一起使用，不同的二抗（如羊抗兔不同的二抗（如羊抗兔IgG和猪抗豚鼠和猪抗豚鼠IgG）也可混合在一起应用，也可混合在一起应用，不同种不同种属的一抗和二抗各自与相应的抗原（属的一抗和二抗各自与相应的抗原（X和和Y）反）反应应，从而将两种抗原同时显示出来（图，从而将两种抗原同时显示出来（图6-2A）。）。 图图6-2 间接异种动物抗体法和双重免疫染色原理间接异种动物抗体法和双重免疫染色原理 3间接法间接法-同种动物抗体法同种动物抗体法 也称分步也称分步固定法。固定法。做第一种染色时，在一抗（兔

48、抗做第一种染色时，在一抗（兔抗X）与）与组织抗原组织抗原X结合后，结合后，用第一种标记二抗（如用第一种标记二抗（如FITC-羊抗兔羊抗兔IgG）饱和饱和一抗（兔抗一抗（兔抗X）上的抗）上的抗原决定簇，原决定簇，这就排除了第二种染色时所用的二抗这就排除了第二种染色时所用的二抗（如（如TRITC-羊抗兔羊抗兔IgG）再与之结合的可能。）再与之结合的可能。此时由于此时由于二抗过量二抗过量，每个，每个FITC-羊抗兔羊抗兔IgG分子分子上的上的两个抗原结合部位（两个抗原结合部位（Fab段）只有其中一个段）只有其中一个与一抗上的抗原决定簇结合，另一个处于游离状与一抗上的抗原决定簇结合，另一个处于游离状态

49、，有态，有可能与下一种染色中的一抗（兔抗可能与下一种染色中的一抗（兔抗Y）交）交叉反应。因此，叉反应。因此，在完成第一种染色后，用多聚甲在完成第一种染色后，用多聚甲醛蒸气处理组织片，醛蒸气处理组织片，使使二抗的游离抗原结合部位二抗的游离抗原结合部位失活失活，即可消除第二种染色中所用的一抗（兔抗，即可消除第二种染色中所用的一抗（兔抗Y）与之发生交叉反应的可能，使各种免疫染色）与之发生交叉反应的可能，使各种免疫染色所用抗体都不再会有交叉反应，从而可以一种接所用抗体都不再会有交叉反应，从而可以一种接一种地进行多种免疫显色（图一种地进行多种免疫显色（图6-3）。 图图6-3 间接法同种动物抗体法（分步

50、固定法）间接法同种动物抗体法（分步固定法）多重免疫染色原理多重免疫染色原理 4标记抗原法标记抗原法: : 应用这一方法前，首先应用这一方法前，首先用不同的用不同的标记物分别标记与待检抗原相同的纯抗原。标记物分别标记与待检抗原相同的纯抗原。染色时先用染色时先用未标记的未标记的特异性抗体与组织抗原反应，特异性抗体与组织抗原反应，由于由于抗体过量抗体过量及及空间结构的原因，每个空间结构的原因，每个特异性抗体特异性抗体IgG分子分子中只有中只有一个一个抗原结合部位（抗原结合部位（Fab段）段）与组织抗原结合，另一个与组织抗原结合，另一个则与则与后来所用的后来所用的标记纯抗原结合标记纯抗原结合，从而显示

51、出相应的组织抗，从而显示出相应的组织抗原的部位。采用本法时，即使抗体不纯也不会影响结果原的部位。采用本法时，即使抗体不纯也不会影响结果的特异性，因为标记好的纯抗原只与相应抗体结合，从的特异性，因为标记好的纯抗原只与相应抗体结合，从而使组织中相应的抗原分别得到特异性显示（图而使组织中相应的抗原分别得到特异性显示（图6-4）。）。图图6-4 标记抗原法免疫双重染色原理标记抗原法免疫双重染色原理 5其他方法其他方法 免疫荧光法和免疫酶法免疫荧光法和免疫酶法的敏感性不同，可以的敏感性不同，可以组合应用组合应用实现双标。先用免疫酶法作第一重染色，由于敏感性高，实现双标。先用免疫酶法作第一重染色，由于敏感

52、性高，一抗可以高度稀释，显色反应后，二抗又被显色反应生成一抗可以高度稀释，显色反应后，二抗又被显色反应生成物包绕，不易与下一重的一抗相结合。此后以免疫荧光法物包绕，不易与下一重的一抗相结合。此后以免疫荧光法作第二重染色，由于敏感性低，所用的抗体系统不会与前作第二重染色，由于敏感性低，所用的抗体系统不会与前一重染色中高度稀释的抗体交叉反应，就能分别标示出不一重染色中高度稀释的抗体交叉反应，就能分别标示出不同抗原。同样，还可将免疫金银法与上两种方法做不同组同抗原。同样，还可将免疫金银法与上两种方法做不同组合，或将免疫金银法与免疫金法组合来实现双标。合，或将免疫金银法与免疫金法组合来实现双标。 二、

53、免疫荧光双标技术免疫荧光双标技术 最适合观察存在于同一细胞内的不同抗原。最适合观察存在于同一细胞内的不同抗原。不同的荧光不同的荧光素在相应的光波激发下会呈现不同的颜色，素在相应的光波激发下会呈现不同的颜色，例如异硫氰荧光例如异硫氰荧光素素（FITC）呈绿色，）呈绿色，异硫氰酸四甲基罗丹明异硫氰酸四甲基罗丹明（TRITC）呈）呈红色荧光红色荧光。把它们分别标记在不同的抗体上，各自与相应的。把它们分别标记在不同的抗体上，各自与相应的抗原相结合，就能实现用不同颜色显示不同的抗原。由于每抗原相结合，就能实现用不同颜色显示不同的抗原。由于每种荧光素在特定波长的光波激发下才呈现相应的荧光（种荧光素在特定波

54、长的光波激发下才呈现相应的荧光（如如FITC在在490nm光波激发下呈绿色，光波激发下呈绿色，TRITC在在546nm光波激光波激发下呈红色），发下呈红色），用荧光显微镜观察双标阳性结果时，可以依用荧光显微镜观察双标阳性结果时，可以依次次选用特定波长的激发滤光片选用特定波长的激发滤光片分别观察。分别观察。 要精确地比较阳性结果，则需用两次曝光的技术，要精确地比较阳性结果，则需用两次曝光的技术，选用彩色底片，先对一种颜色荧光显示的阳性结果拍选用彩色底片，先对一种颜色荧光显示的阳性结果拍照，然后转换激发滤光片，对另一种颜色荧光显示的照，然后转换激发滤光片，对另一种颜色荧光显示的阳性结果作第二次曝光

55、，此时不可移动载玻片，以保阳性结果作第二次曝光，此时不可移动载玻片，以保证切片上不同颜色代表的相应抗原，可以分析比较它证切片上不同颜色代表的相应抗原，可以分析比较它们相互间的关系。也可以不移动切片，同时拍两张不们相互间的关系。也可以不移动切片，同时拍两张不同颜色荧光照片，比较抗原存在部分，对处于同一细同颜色荧光照片，比较抗原存在部分，对处于同一细胞内的抗原，用这种方法观察结果较好。有时在同一胞内的抗原，用这种方法观察结果较好。有时在同一波长观察两种荧光，并进行照相也能得到较满意的结波长观察两种荧光，并进行照相也能得到较满意的结果。果。 （一）洗脱法（一）洗脱法 用同种动物产生的特异性抗血清为一

56、抗（如兔抗用同种动物产生的特异性抗血清为一抗（如兔抗X抗原及兔抗抗原及兔抗Y抗原血清），二抗也由一种动物产生（如抗原血清），二抗也由一种动物产生（如羊抗兔羊抗兔IgG），但用不同颜色的荧光素分别标记（如），但用不同颜色的荧光素分别标记（如FITC-羊抗兔羊抗兔IgG及及TRITC-羊抗兔羊抗兔IgG）。 1 1设备与试剂设备与试剂 （1 1）湿盒，冰箱和烤箱。）湿盒，冰箱和烤箱。 （2 2）伊文蓝溶液：取伊文蓝）伊文蓝溶液：取伊文蓝lglg溶解于溶解于l00ml PBSl00ml PBS中，加中，加入入1%NaN1%NaN3 3 1m11m1。过滤后。过滤后 贮存于贮存于44冰箱中。用前取冰箱

57、中。用前取0.1ml0.1ml，加加PBS 9.9mlPBS 9.9ml稀释成稀释成0.01%0.01%浓度使用。浓度使用。n （3）洗脱液：）洗脱液：12.5%高锰酸钾（高锰酸钾（KMn2O4）1ml，5%硫酸（硫酸（H2SO4）1ml，加蒸馏水，加蒸馏水140ml混匀而成。混匀而成。n （4）0.5%焦亚硫酸纳还原液：焦亚硫酸纳还原液：500mg焦亚硫酸钠焦亚硫酸钠（Na2S2O5）加蒸馏水至）加蒸馏水至l00ml。n （5）甲基绿溶液：）甲基绿溶液：0.1%甲基绿甲基绿4m1加入加入PBS 36ml混混匀。匀。n （6）缓冲甘油：纯甘油（分析纯）缓冲甘油：纯甘油（分析纯）20ml，加入，

58、加入0.5mol/L碳酸缓冲液（碳酸缓冲液（pH9.5）20m1，充分混匀，待其，充分混匀，待其中气泡完全消失，即可使用。中气泡完全消失，即可使用。n （7）0.5mol/L碳酸缓冲液（碳酸缓冲液（pH9.5）：将）：将NaHCO3 3.7g，Na2CO2 0.6g溶解于溶解于l00m1蒸馏水中，混合，调蒸馏水中，混合，调pH至至9.5。n 2操作步骤操作步骤n （1）石蜡切片经二甲苯脱蜡，降乙醇至水；固定组织）石蜡切片经二甲苯脱蜡，降乙醇至水；固定组织的恒冷切片，直接入的恒冷切片，直接入0.01mol/L PBS；新鲜组织的恒冷切片，；新鲜组织的恒冷切片，室温干燥室温干燥3060min，在，

59、在100%冷丙酮内固定冷丙酮内固定5l0min后入后入PBS，组织周边擦干。，组织周边擦干。n （2）滴加适当稀释度的免疫血清，在湿盒、）滴加适当稀释度的免疫血清，在湿盒、37温箱温箱中放置中放置3060min，或在，或在4冰箱中过夜。冰箱中过夜。n （3）PBS洗洗3次，每次次，每次5min，吸水纸吸去残留液。，吸水纸吸去残留液。n （4）滴加适当稀释度的间接荧光抗体（用）滴加适当稀释度的间接荧光抗体（用0.01%伊文伊文蓝溶液稀释，以消除非特异性自发荧光），在湿盒中蓝溶液稀释，以消除非特异性自发荧光），在湿盒中37放置放置3060min。 （5）PBS洗洗2次，每次次，每次5min，再用蒸

60、馏水洗，再用蒸馏水洗1min。（6）甘油缓冲液封固，荧光显微镜观察，拍照。）甘油缓冲液封固，荧光显微镜观察，拍照。（7）PBS泡数分钟，去除封固，蒸溜水洗泡数分钟，去除封固，蒸溜水洗50min。（8）入洗脱液，洗脱时间随切片厚度而定，一般）入洗脱液，洗脱时间随切片厚度而定，一般为为15min，较厚的振动切片，需，较厚的振动切片，需10min以上。以上。（9）切片置入）切片置入0.5%焦亚硫酸钠液焦亚硫酸钠液30s。（10）流水冲洗）流水冲洗1020min，蒸馏水浸，蒸馏水浸5min。（11）重复步骤）重复步骤26进行第二重免疫荧光染色。进行第二重免疫荧光染色。n 若需要，可用甲基绿套染核，染色