生物传感器知识

1、2021/3/2312021/3/232 由于生物传感器它具有集信息采集、转换、由于生物传感器它具有集信息采集、转换、传输、表达于一身的特点传输、表达于一身的特点,且其测定简便、快速且其测定简便、快速,装置简单装置简单,价格低廉价格低廉,选择性优异选择性优异,应用面广等众多应用面广等众多优点优点,因而深受研究者的青睐。同时因而深受研究者的青睐。同时,由于生物传由于生物传感器易于组成生物传感器阵列感器易于组成生物传感器阵列,通过与微型流路、通过与微型流路、微型泵和微型阀的配合微型泵和微型阀的配合,构成生物分析芯片构成生物分析芯片,从而从而可实现对多个参数同时进行检测。由此可见可实现对多个参数同时

2、进行检测。由此可见,基基于生物传感器的生物分析芯片的应用于生物传感器的生物分析芯片的应用,将成为医将成为医疗检测仪器的一个重要发展方向。疗检测仪器的一个重要发展方向。2021/3/233 生物传感器生物传感器(Biosensor)(Biosensor)是一种以生物活性单元（如是一种以生物活性单元（如: :酶、抗体、核酸、细胞等）作为敏感基元酶、抗体、核酸、细胞等）作为敏感基元, ,对被分析对被分析物具有物具有高度选择性高度选择性的现代化分析仪器单元。它通过的现代化分析仪器单元。它通过各种物理、化学换能器捕捉目标物与敏感基元之间各种物理、化学换能器捕捉目标物与敏感基元之间的反应的反应, ,然后将

3、反应的程度用离散或连续的数字电信然后将反应的程度用离散或连续的数字电信号表达出来号表达出来, ,从而得出被分析物的浓度。从而得出被分析物的浓度。19621962年年ClarkClark在纽约自然科学学会的论文集中首次提出了在纽约自然科学学会的论文集中首次提出了“在化学电极的敏感膜中加入酶以实现对目标物进在化学电极的敏感膜中加入酶以实现对目标物进行选择性分析行选择性分析”的设想。这一设想经过的设想。这一设想经过UpdikeUpdike等人等人的发展后的发展后, ,于于19691969年由年由GuilbaultGuilbault和和MontalvoMontalvo得以实得以实现。现。 2021/3

4、/234 就生物传感器而言就生物传感器而言, ,它的敏感元件主要由它的敏感元件主要由两部分组两部分组成成: :敏感基元和换能器敏感基元和换能器。敏感基元指的是对目标物。敏感基元指的是对目标物进行选择性作用的生物活性单元。最先被使用的进行选择性作用的生物活性单元。最先被使用的是具有高度选择催化活性的酶。是具有高度选择催化活性的酶。 酶或是以物理方法（包埋、吸附等）酶或是以物理方法（包埋、吸附等）, ,或是以化学或是以化学方法方法 (a) (a) 质量检测质量检测, ,如质量如质量, ,频率等。频率等。 (b) (b) 电特性检测电特性检测, ,如电量如电量, ,电阻等。电阻等。 (c) (c)

5、光检测光检测, ,如折射角如折射角, ,光强等。光强等。 (d) SPR (d) SPR (e) (e) 光谱检测光谱检测 (f) Mach-Zehnder Interferometer. A: (f) Mach-Zehnder Interferometer. A: 被检测被检测物质物质, , R: R: 敏感物质。见下图。敏感物质。见下图。2021/3/235 (a) 质量检测，如质量，频率等。质量检测，如质量，频率等。(b) 电特性检测，如电量，电阻等。电特性检测，如电量，电阻等。(c) 光检测，如折射角，光强等。光检测，如折射角，光强等。(d) SPR (e) 光谱检测光谱检测 (f)

6、Mach-Zehnder Interferometer. A: 被检测物质，被检测物质， R: 敏感物质。敏感物质。图图8-2. 生物传感器的分类生物传感器的分类2021/3/236 若是按照检测手段来分类的话若是按照检测手段来分类的话, ,生物芯片中应用的主要检生物芯片中应用的主要检测手段有以下几种测手段有以下几种: : 质量法质量法。这种方法主要是对传感器上质量变化进行检测。这种方法主要是对传感器上质量变化进行检测, ,常用方法有常用方法有QCMQCM等。等。 电特性检测电特性检测。这种方法主要通过传感器的电特性参量的变。这种方法主要通过传感器的电特性参量的变化进行检测。主要有电流法化进行

7、检测。主要有电流法, ,电位法电位法, ,电导法等。电导法等。 光信号检测。光信号检测。这种方法主要是利用光特性的变化量进行检这种方法主要是利用光特性的变化量进行检测测, ,如折射角如折射角, ,光强等光强等 SPRSPR法法。这是最近几年出现的一种检测方法。这是最近几年出现的一种检测方法, ,表面等离子体表面等离子体子共振子共振(SPR)(SPR)技术是一种简单、直接的传感技术。它通过技术是一种简单、直接的传感技术。它通过测量金属表面附近折射率的变化测量金属表面附近折射率的变化, ,来研究物质的性质。表来研究物质的性质。表面等离子体子共振传感器已经成为生物传感器研究领域的面等离子体子共振传感

8、器已经成为生物传感器研究领域的热点。热点。 光谱法光谱法。 Mach-Zehnder InterferometerMach-Zehnder Interferometer。 所谓的分析生物芯片技术所谓的分析生物芯片技术, ,就是采用生物传感器阵列作为就是采用生物传感器阵列作为检测元件检测元件, ,利用微加工技术构成利用微加工技术构成mTASmTAS系统系统, ,从而实现复杂体从而实现复杂体系下的血液多参数微量分析。因而在生物芯片技术研究领系下的血液多参数微量分析。因而在生物芯片技术研究领域中域中, ,一个极为重要的核心内容就是生物传感器。一个极为重要的核心内容就是生物传感器。2021/3/237

9、 生物传感器的分类法生物传感器的分类法 敏感基元通过交联、聚合等方法固定在化学传感敏感基元通过交联、聚合等方法固定在化学传感器的敏感膜中器的敏感膜中, ,然后以化学电极作为换能器测定酶催然后以化学电极作为换能器测定酶催化目标物反应所生成的特定产物的浓度化目标物反应所生成的特定产物的浓度, ,从而间接地从而间接地测定目标物的浓度。随着物理检测手段的引入测定目标物的浓度。随着物理检测手段的引入, ,人们人们已成功地把抗体、已成功地把抗体、DNADNA聚合物、核酸、细胞受体和完聚合物、核酸、细胞受体和完整细胞等具有特异选择性作用功能的生物活性单元用整细胞等具有特异选择性作用功能的生物活性单元用作了敏

10、感基元。作了敏感基元。 根据根据敏感基元敏感基元的工作原理的不同的工作原理的不同, ,生物传感器可以生物传感器可以被分为两类被分为两类: :即即催化型生物传感器和亲和型生物传感催化型生物传感器和亲和型生物传感器器。前者利用了如酶等生物敏感基元的专一性和催化。前者利用了如酶等生物敏感基元的专一性和催化性性, ,它检测的是整个反应动力学过程的总效应它检测的是整个反应动力学过程的总效应; ;后者利后者利用了分子间特异的亲和性用了分子间特异的亲和性, ,如免疫传感器等如免疫传感器等, ,它检测的它检测的是热力学平衡的结果。是热力学平衡的结果。2021/3/238 目前目前, ,生物传感器中主要的生物敏

11、感基元有生物传感器中主要的生物敏感基元有4 4种种: : 酶酶 酶是生化反应的高效催化剂酶是生化反应的高效催化剂, ,对目标物具有高度的专对目标物具有高度的专一性。在反应过程中一性。在反应过程中, ,利用氧化还原酶的电子转移。利用氧化还原酶的电子转移。或利用反应前后目标物或产物的浓度变化进行检测。或利用反应前后目标物或产物的浓度变化进行检测。基于酶的生物传感器目前应用较为广泛。基于酶的生物传感器目前应用较为广泛。 抗原和抗体抗原和抗体 抗原是能被动物组织成为一种外源性物质进行特异性抗原是能被动物组织成为一种外源性物质进行特异性识别的物质分子识别的物质分子, ,相伴随产生的防护性机制称之为免相伴

12、随产生的防护性机制称之为免疫反应。通过疫反应。通过抗原和抗体抗原和抗体在换能器在换能器表面的结合表面的结合,利用质量检测的方法或利用质量检测的方法或SPRSPR方法进行检测。方法进行检测。 2021/3/239受体受体利用受体与特定目标物的结合利用受体与特定目标物的结合, ,通过通过QCMQCM或或SPRSPR技技术进行检测。目前术进行检测。目前, ,作为识别元件用于生物传感作为识别元件用于生物传感器研究实验器研究实验, ,大部分只限于烟酰胺乙酰胆碱受体大部分只限于烟酰胺乙酰胆碱受体（n n-AChR-AChR）, ,这主要是由于其他受体在生物体中这主要是由于其他受体在生物体中只存在很小量只存

13、在很小量, ,不易分离而大量获得。不易分离而大量获得。核酸核酸核酸具有最高的生物选择性核酸具有最高的生物选择性, ,利用核酸分子杂交利用核酸分子杂交的原理对目标物进行检测的核酸生物传感器从的原理对目标物进行检测的核酸生物传感器从理论上讲具有极其美好的发展前景理论上讲具有极其美好的发展前景, ,因而成为目因而成为目前生物传感器研究领域最前沿的研究课题。前生物传感器研究领域最前沿的研究课题。2021/3/2310生物传感器分类生物传感器分类生物芯片2021/3/23112021/3/23122021/3/23132021/3/231422021/3/23152021/3/23162021/3/23

14、172021/3/2318尿酸测定尿酸测定2021/3/23192021/3/23202021/3/23212021/3/23222021/3/23232021/3/23242021/3/23252021/3/23262021/3/23272021/3/23282021/3/23292021/3/23302021/3/23312021/3/23322021/3/23332021/3/23342021/3/23352021/3/23362021/3/2337 Fig1 Measurement system A: carrier fluid (buffer) B: urea sample; C:

15、FIA pump; D: enzyme column; E: pH-ISFET; F: flow-through cell; R: reference electrode M: signal manage circuit; W: waste solution. An FIA System with enzyme column and ISFET detector for determination of Urea2021/3/2338fig3 urea concentration calibrated curve2021/3/23392021/3/2340 生物芯片技术生物芯片技术, ,被誉为

16、被誉为2121世纪生命科学的支撑技术世纪生命科学的支撑技术, ,是半导是半导体技术和生物技术联姻的结果体技术和生物技术联姻的结果, ,是便携式生化分析仪器的技术是便携式生化分析仪器的技术核心。该技术利用微电子工业技术核心。该技术利用微电子工业技术, ,将现在生命科学研究中将现在生命科学研究中“各自为阵各自为阵”的分析过程集成在一块指甲大小的生物芯片上。的分析过程集成在一块指甲大小的生物芯片上。使生命科学及医学工作者可以在方寸之上进行和完成一系列实使生命科学及医学工作者可以在方寸之上进行和完成一系列实验程序验程序, ,专家们因此将其称之为专家们因此将其称之为“微缩芯片实验室微缩芯片实验室”。它的

17、发。它的发展同当年需要数间房屋放置的分离元件计算机被微缩成现在只展同当年需要数间房屋放置的分离元件计算机被微缩成现在只有笔记本大小的电脑有异曲同工之效。采用该技术可进行生命有笔记本大小的电脑有异曲同工之效。采用该技术可进行生命科学和医学科学所涉及的各种生物化学反应实验科学和医学科学所涉及的各种生物化学反应实验, ,从而达到对从而达到对各项生化指标进行测试分析的目的。各项生化指标进行测试分析的目的。生物芯片生物芯片2021/3/2341生物芯片技术的出现将会给生命科学、医学科学、化学、新生物芯片技术的出现将会给生命科学、医学科学、化学、新药开发、生物武器研制、外太空探索、司法鉴定、食品和环药开发

18、、生物武器研制、外太空探索、司法鉴定、食品和环境监测等领域带来一场革命。正是由于生物芯片技术对科学境监测等领域带来一场革命。正是由于生物芯片技术对科学研究的发展具有极其重要的意义研究的发展具有极其重要的意义,以及它的广泛的应用前景及以及它的广泛的应用前景及巨大的商业利益巨大的商业利益,世界上许多国家和地区以高额投入和大量的世界上许多国家和地区以高额投入和大量的人力对此领域开展了大量的基础研究和应用开发人力对此领域开展了大量的基础研究和应用开发,并形成了一并形成了一批相关产业。批相关产业。 美国美国财富财富杂志曾撰文指出杂志曾撰文指出“微处理器使我们的经微处理器使我们的经济发生了根本变化济发生了

19、根本变化,给人类带来了巨大的财富给人类带来了巨大的财富,改变了我们改变了我们的生活方式。然而的生活方式。然而,生物芯片给人类带来的影响可能更生物芯片给人类带来的影响可能更大。大。”事实已经表明事实已经表明,生物芯片技术已经成为全球科学界生物芯片技术已经成为全球科学界瞩目的瞩目的“热点热点”,是继微电子技术之后是继微电子技术之后,高科技领域的又一高科技领域的又一场决战。场决战。2021/3/2342目前目前, ,国内外研究单位所研发的生物芯片国内外研究单位所研发的生物芯片, ,如果按应用领域分类如果按应用领域分类, ,可以分为可以分为基因芯片基因芯片、蛋白质分析用生物芯片蛋白质分析用生物芯片、P

20、CRPCR芯片芯片、以及、以及血液分析用生物芯片血液分析用生物芯片等几类等几类; ;如果按内在集成功能分类如果按内在集成功能分类, ,可以分可以分为主动式生物芯片和被动式生物芯片两类。为主动式生物芯片和被动式生物芯片两类。被动式生物芯片被动式生物芯片的实质是在面积不大的基片上有序地点的实质是在面积不大的基片上有序地点阵排列了一系列固定于一定位置的可寻址的敏感物质阵排列了一系列固定于一定位置的可寻址的敏感物质, ,结合或结合或反应在相同条件下进行。反应结果用各种物理或化学手段进行反应在相同条件下进行。反应结果用各种物理或化学手段进行转换成电信号转换成电信号, ,通过计算机进行分析处理通过计算机进

21、行分析处理, ,综合成可读的数据信综合成可读的数据信息。利用被动式生物芯片进行芯片分析可以大大提高检测效率息。利用被动式生物芯片进行芯片分析可以大大提高检测效率, ,减少工作量减少工作量, ,增加可比性。但实验人员无法对芯片上的生物及增加可比性。但实验人员无法对芯片上的生物及化学反应进行动力学以及反应特异性的人为地控制。被动式生化学反应进行动力学以及反应特异性的人为地控制。被动式生物芯片构成简单物芯片构成简单, ,目前目前, ,国内外大多数研究单位所研发的多是这国内外大多数研究单位所研发的多是这类芯片。在人类基因组计划中发挥重要作用的基因芯片就属于类芯片。在人类基因组计划中发挥重要作用的基因芯

22、片就属于被动式生物芯片。被动式生物芯片。2021/3/2343 主动式生物芯片主动式生物芯片的实质是在被动式生物的实质是在被动式生物芯片的基础上芯片的基础上, ,在基片上同时集成有微型流在基片上同时集成有微型流路路, ,微型阀和微型泵等部分微型阀和微型泵等部分, ,利用他们对发利用他们对发生在芯片上的生物及化学反应进行人为控生在芯片上的生物及化学反应进行人为控制。主动式生物芯片又被称为芯片型实验制。主动式生物芯片又被称为芯片型实验室（室（Lab on a chipLab on a chip）, ,它是它是9090年代后出现年代后出现的一个新的研究领域。顾名思义的一个新的研究领域。顾名思义, ,

23、它是以芯它是以芯片分析为基础片分析为基础, ,其功能已从单一分析测定发其功能已从单一分析测定发展为集各种分析化学所需的实验室基本操展为集各种分析化学所需的实验室基本操作于一体的作于一体的“微型实验室微型实验室”。2021/3/2344“芯片实验室芯片实验室”是一个理想化的新概念是一个理想化的新概念, ,而而mTAS(Miniaturized mTAS(Miniaturized Total Analysis System)Total Analysis System)系统则是一个具体的科学新概念。图系统则是一个具体的科学新概念。图1-11-1为为P. Bergveld P. Bergveld 于于

24、19941994年在年在 “The challenge of developing The challenge of developing mTAS”mTAS”中给出的中给出的“芯片实验室芯片实验室”结构示意图。结构示意图。图图8-1 芯片实验室概念图芯片实验室概念图2021/3/2345 生物芯片的种类生物芯片的种类生物芯片技术的主要用途就是对各种生物化学参数进行快生物芯片技术的主要用途就是对各种生物化学参数进行快速、简便、高效、准确的检测速、简便、高效、准确的检测, ,如果按检测内容类分类的话如果按检测内容类分类的话, ,生物芯片可以分为以下几类生物芯片可以分为以下几类: : 蛋白质检测生

25、物芯片蛋白质检测生物芯片。这种生物芯片主要是利用毛细管电泳。这种生物芯片主要是利用毛细管电泳检测技术检测技术, ,通过不同种类蛋白质分子量的不同进行检测。通过不同种类蛋白质分子量的不同进行检测。 DNADNA检测生物芯片检测生物芯片。这种生物芯片主要是利用。这种生物芯片主要是利用DNADNA螺旋结构的螺旋结构的互补性互补性, ,对不同种类的对不同种类的DNADNA分子进行检测。分子进行检测。 血液参数检测生物芯片血液参数检测生物芯片。这种生物芯片是利用生物酶催化的。这种生物芯片是利用生物酶催化的单一性单一性, ,利用电化学方法利用电化学方法, ,或荧光检测方法对不同的生化参数或荧光检测方法对不

26、同的生化参数进行检测。进行检测。 PCRPCR生物芯片生物芯片。这种生物芯片是利用。这种生物芯片是利用DNADNA双螺旋结构在酶的催双螺旋结构在酶的催化下化下, ,在一定温度条件下会裂解、复制的特性在一定温度条件下会裂解、复制的特性, ,进行进行DNADNA分子的分子的大量复制大量复制, ,是进行是进行DNADNA检测的必要步骤。检测的必要步骤。2021/3/2346 若是按照检测手段来分类的话若是按照检测手段来分类的话, ,生物芯片中应用的主要检测手段生物芯片中应用的主要检测手段有以下几种有以下几种: : 质量法质量法。这种方法主要是对传感器上质量变化进行检测。这种方法主要是对传感器上质量变

27、化进行检测, ,常用方常用方法有法有QCMQCM等。等。 电特性检测电特性检测。这种方法主要通过传感器的电特性参量的变化进行。这种方法主要通过传感器的电特性参量的变化进行检测。主要有电流法检测。主要有电流法, ,电位法电位法, ,电导法等。电导法等。 光信号检测。这种方法主要是利用光特性的变化量进行检测光信号检测。这种方法主要是利用光特性的变化量进行检测, ,如如折射角折射角, ,光强等光强等 SPRSPR法法。这是最近几年出现的一种检测方法。这是最近几年出现的一种检测方法, ,表面等离子体子共振表面等离子体子共振(SPR)(SPR)技术是一种简单、直接的传感技术。它通过测量金属表面技术是一种

28、简单、直接的传感技术。它通过测量金属表面附近折射率的变化附近折射率的变化, ,来研究物质的性质。表面等离子体子共振传来研究物质的性质。表面等离子体子共振传感器已经成为生物传感器研究领域的热点。感器已经成为生物传感器研究领域的热点。 光谱法光谱法。 Mach-Zehnder InterferometerMach-Zehnder Interferometer。 所谓的分析生物芯片技术所谓的分析生物芯片技术, ,就是采用生物传感器阵列作为检测元就是采用生物传感器阵列作为检测元件件, ,利用微加工技术构成利用微加工技术构成mTASmTAS系统系统, ,从而实现复杂体系下的血液多从而实现复杂体系下的血液

29、多参数微量分析。因而在生物芯片技术研究领域中参数微量分析。因而在生物芯片技术研究领域中, ,一个极为重要一个极为重要的核心内容就是生物传感器。的核心内容就是生物传感器。2021/3/2347 聚合酶链反应聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是是8080年年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点; ;能在一个试管内将所要研究能在一个试

30、管内将所要研究 的目的基因或某一的目的基因或某一DNADNA片段于片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍数小时内扩增至十万乃至百万倍, ,使肉眼能直接观察和判使肉眼能直接观察和判断断; ;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的的DNADNA供分析研供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情的事情, ,用用PCRPCR几小时便可完成。几小时便可完成。PCRPCR技术是生物医学领域技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。中的一项革命性创举和里程碑。 PCR芯片芯片2021/3/2348 1 PC

31、R的定义的定义 聚合酶链式反应即聚合酶链式反应即PCRPCR是指在引物指导下由酶催化是指在引物指导下由酶催化的对特定的克隆或基因组的对特定的克隆或基因组DNADNA序列进行的扩增反应。序列进行的扩增反应。该方法最早由该方法最早由Mullis5Mullis5于于19871987年提出的年提出的, ,现已成为分现已成为分子生物学实验室常规的操作子生物学实验室常规的操作, ,并已实现自动化。模板并已实现自动化。模板DNADNA中包含目的序列中包含目的序列, ,长短由几十到几千个碱基对不等。长短由几十到几千个碱基对不等。反应缓冲液中含有相对过量的寡核苷酸引物和反应缓冲液中含有相对过量的寡核苷酸引物和4

32、 4种脱种脱氧核苷酸氧核苷酸, ,反应由一种对热稳定的反应由一种对热稳定的DNADNA聚合酶聚合酶, ,如常用如常用的的Taq DNATaq DNA聚合酶催化聚合酶催化, ,通过对目的序列的指数性扩增通过对目的序列的指数性扩增, ,结果可以获得数百万倍拷贝的目的序列。尽管结果可以获得数百万倍拷贝的目的序列。尽管PCRPCR本本身只能用于扩增身只能用于扩增DNADNA, ,但也可用但也可用RNARNA做最初材料反转录做最初材料反转录生成生成DNADNA后再进行后再进行PCRPCR。2021/3/2349 基因芯片主要有两种类型基因芯片主要有两种类型: : 其一可称为微芯片其一可称为微芯片, ,即

33、利用微加工技术即利用微加工技术, ,在固相载体上刻蚀在固相载体上刻蚀出基于不同目的而形状各异的生物样品微型反应池和类似出基于不同目的而形状各异的生物样品微型反应池和类似于毛细血管电泳的分离和检测系统等。于毛细血管电泳的分离和检测系统等。 另一类可称为寡核苷酸阵列芯片另一类可称为寡核苷酸阵列芯片。是借助定点固相合成技。是借助定点固相合成技术或探针固定化技术术或探针固定化技术, ,将一系列不同序列的寡核苷酸按阵将一系列不同序列的寡核苷酸按阵列分布固定于固象载体上列分布固定于固象载体上, ,再基于核酸杂交原理再基于核酸杂交原理, ,实现对生实现对生物样品中靶基因序列进行测定物样品中靶基因序列进行测定

34、, ,目前常指的基因芯片属于目前常指的基因芯片属于第二种类型第二种类型, ,其主要特点是一个芯片可完成数百次的常规其主要特点是一个芯片可完成数百次的常规测试测试, ,简化了测试过程简化了测试过程, ,使得在短时间内可采集大量信息。使得在短时间内可采集大量信息。 2021/3/2350 从从8080年代到年代到9090年代初在不到年代初在不到1010年的时年的时间内间内, ,基因芯片得以迅速发展基因芯片得以迅速发展, ,并呈现发展并呈现发展高峰高峰, ,目前的美国目前的美国AffymetrixAffymetrix公司已可以在公司已可以在约约1 1平方厘米的玻璃芯片上固定包含平方厘米的玻璃芯片上固

35、定包含4040万种万种寡核苷酸在内的寡核苷酸在内的DNADNA探针探针, ,1010块这样的芯片块这样的芯片即可对人类的全部基因组序列进行扫描即可对人类的全部基因组序列进行扫描。 2021/3/2351 一一, PCR芯片的分类芯片的分类 目前目前, ,市场上所见到的市场上所见到的PCRPCR扩增器（热循环仪多为离心管扩增器（热循环仪多为离心管式）反应室容积较大式）反应室容积较大, ,升降温相对缓慢升降温相对缓慢, ,时间长。这不但耗时间长。这不但耗费昂贵的引物、聚合酶及载液等费昂贵的引物、聚合酶及载液等, ,并且由于反应物量大并且由于反应物量大, ,单单次循环次循环/ /扩增扩增( (变性、

36、退火、延伸变性、退火、延伸) )所需循环时间较长所需循环时间较长, ,对于对于单个单个DNADNA分子分子1k1k拷贝的扩增拷贝的扩增, ,一般要一般要1010次热循环以上次热循环以上, ,所需所需时间长达数十分钟甚至几个小时。对于可方便检测的时间长达数十分钟甚至几个小时。对于可方便检测的10k10k拷贝以上的扩增所耗费的时间更长。这限制拷贝以上的扩增所耗费的时间更长。这限制PCRPCR技术在生技术在生物及医学领域中的应用。而九十年代是物及医学领域中的应用。而九十年代是MEMSMEMS技术逐渐成熟技术逐渐成熟的年代的年代, ,利用利用MEMSMEMS中的微机械加工技术制作的微小反应室中的微机械

37、加工技术制作的微小反应室, ,不但实现了器件的微型化、用样的微量化不但实现了器件的微型化、用样的微量化, ,倍增的快速化倍增的快速化, ,并且进一步实现并且进一步实现DNADNA的扩增、分离及检测的单片集成化的扩增、分离及检测的单片集成化, ,是是一种可望取代一种可望取代PCRPCR热循环仪等的新型热循环仪等的新型LOC (Lab-On-Chip)LOC (Lab-On-Chip), ,是九十年代中期以后国际上生物芯片技术与是九十年代中期以后国际上生物芯片技术与MEMSMEMS技术的研技术的研究热点之一究热点之一1-21-2。2021/3/2352国际上对国际上对PCR生物芯片的研究主要集中在

38、微井式、生物芯片的研究主要集中在微井式、连续流式和集成式三种形式连续流式和集成式三种形式。 1.微井式微井式PCR芯片芯片图1-1 微井式PCR结构示意图19931993年加州大学年加州大学Berkeley3-4Berkeley3-4分校的分校的BSACBSAC中心与加州的中心与加州的LawrenceLawrence国家实验室等联合报道了一种基于微机械加工技国家实验室等联合报道了一种基于微机械加工技术的术的PCRPCR芯片芯片, ,这是所见到的最早的这是所见到的最早的PCRPCR生物芯片生物芯片。 2021/3/2353 2.连续流式连续流式PCR芯片芯片相对相对PCR扩增器而言扩增器而言,连

39、续流连续流PCR芯片技术研究在国际上还处于刚刚芯片技术研究在国际上还处于刚刚起步的阶段。起步的阶段。 PCR芯片技术像其它高新技术一样芯片技术像其它高新技术一样,在在IC平面工艺和平面工艺和MEMS技术的推技术的推动下动下,向集成化方向迅速推进。微米泵、导向阀门、样品加注通道、向集成化方向迅速推进。微米泵、导向阀门、样品加注通道、混合室、混合室、PCR反应室、毛细管电泳分离及反应室、毛细管电泳分离及DNA检测集成在一起不但消除分析检测集成在一起不但消除分析中人工操作的环节中人工操作的环节,大大加快大大加快DNA分析的速度分析的速度,而且避免了而且避免了PCR产物的产物的传递、存储及其带来的一系

40、列问题。高集成度的片上实验室传递、存储及其带来的一系列问题。高集成度的片上实验室5（Lab-on-chip, LOC）是）是PCR芯片未来发展的重要方向之一。芯片未来发展的重要方向之一。 图图1-2 Burns所研制的集成化所研制的集成化PCR芯片示意图芯片示意图 2021/3/2354 宾夕法尼亚大学的宾夕法尼亚大学的Mann A. ShoffnerMann A. Shoffner等人报道了类似等人报道了类似结构的结构的PCRPCR芯片芯片, ,采用了标准的微机械加工技术（薄膜生长采用了标准的微机械加工技术（薄膜生长或淀积或淀积, ,光刻、单晶硅各项异性腐蚀、硅光刻、单晶硅各项异性腐蚀、硅-

41、 -玻璃静电键合等）玻璃静电键合等）制作了尺寸为制作了尺寸为14mm14mm17mm17mm的的PCRPCR芯片。玻璃盖片与单晶硅芯片。玻璃盖片与单晶硅（上面预先刻蚀了（上面预先刻蚀了115115微米深的腔体）通过静电键合在一微米深的腔体）通过静电键合在一起形成起形成PCRPCR反应室。反应室。PCRPCR反应以空肠弯菌（反应以空肠弯菌（Campylobacter Campylobacter jejunijejuni）DANDAN为模板为模板, ,对对1212微升的反应液进行热循环。为了微升的反应液进行热循环。为了考察反应室内表面钝化层对考察反应室内表面钝化层对PCRPCR的影响的影响, ,他

42、们对反应室内表他们对反应室内表面作了各种化学修饰（热生长及化学淀积面作了各种化学修饰（热生长及化学淀积 SiO2SiO2、Si3N4Si3N4等等薄膜）后进行同样条件的薄膜）后进行同样条件的PCRPCR反应反应, ,并且与传统并且与传统PCRPCR结果进结果进行了比较。结果表明行了比较。结果表明, ,单晶硅及氮化硅对单晶硅及氮化硅对PCRPCR都有大的抑制都有大的抑制作用作用, ,经二氧化硅修饰的经二氧化硅修饰的PCRPCR芯片可取得与传统毛细芯片可取得与传统毛细PCRPCR管管同样的扩增效果。同样的扩增效果。2021/3/2355 芯片由单晶硅片与玻璃构成（如图芯片由单晶硅片与玻璃构成（如图

43、1-11-1所示）。采用了热所示）。采用了热生长、化学气象淀积、光刻、腐蚀等普通的生长、化学气象淀积、光刻、腐蚀等普通的ICIC平面工艺技平面工艺技术术, ,在单晶硅上腐蚀了在单晶硅上腐蚀了10mmX10mmX0.5mm10mmX10mmX0.5mm的腔的腔, ,与玻璃片通与玻璃片通过硅橡胶密封过硅橡胶密封, ,形成形成PCRPCR反应室反应室, ,并且封入了并且封入了1mm1mm聚乙烯导入聚乙烯导入/ /导出管导出管, ,用于反应物的加注及导出。淀积用于反应物的加注及导出。淀积25002500埃的多晶硅埃的多晶硅作为反应室底部加热源。反应室内部温度的测量元件由作为反应室底部加热源。反应室内部

44、温度的测量元件由Cr/AlCr/Al构成构成, ,芯片内反应室容积芯片内反应室容积5050微升。对反应室加样后进微升。对反应室加样后进行温度循环试验。温度控制精度为行温度循环试验。温度控制精度为+/-1.5+/-1.5, ,在主动加热、在主动加热、被动冷却下（被动冷却下（9494到到5555, ,环境温度为环境温度为2525）升温及降温）升温及降温速度可达速度可达15/S15/S。对于。对于2525微升的反应室其最大升降温速度微升的反应室其最大升降温速度可达可达35/S35/S。2021/3/2356Burns所研制的集成化PCR芯片示意 图 纳升级DNA分析芯片2021/3/2357 2 P

45、CR2 PCR循环循环 PCRPCR的主要内容就是重复性的循环的主要内容就是重复性的循环, ,其中每一循环包括三个基其中每一循环包括三个基本步骤本步骤: :高温下双链高温下双链DNADNA变性解链变性解链, ,需要在需要在9494以上保温以上保温1-21-2分钟分钟; ;低温下寡核苷酸引物与单链模板配对退火或杂交低温下寡核苷酸引物与单链模板配对退火或杂交, ,需要在需要在50-55 50-55 保温保温1-21-2分钟分钟, ,在酶催化下由引物延伸在酶催化下由引物延伸, ,合成完整的目的片段拷合成完整的目的片段拷贝贝, ,该拷贝又可作为下一循环的模板。该过程需要在该拷贝又可作为下一循环的模板。

46、该过程需要在72 72 保温保温1-21-2分钟。引物的分钟。引物的33端必须与目的片段精确互补端必须与目的片段精确互补, ,而而55端可以是端可以是非互补性的尾巴非互补性的尾巴, ,通常是内切酶位点序列或启动子序列通常是内切酶位点序列或启动子序列, ,在在PCRPCR中中同样被合成。随着循环的进行同样被合成。随着循环的进行, ,原来的模板和新合成的目的片段原来的模板和新合成的目的片段均作为底物参与变性、退火、延伸等反应。理论上讲（即假定扩均作为底物参与变性、退火、延伸等反应。理论上讲（即假定扩增效率为增效率为100%100%）, ,每一轮循环结束以后每一轮循环结束以后, ,目的片段的数量要增

47、加一目的片段的数量要增加一倍倍, ,即呈几何级数增加。上面已经假定即呈几何级数增加。上面已经假定, ,三步循环中的每一步都有三步循环中的每一步都有最短的有效反应时间最短的有效反应时间, ,而每一步反应的时间太长则不仅浪费而每一步反应的时间太长则不仅浪费, ,而且而且不利于不利于DNADNA聚合酶的活性。另一方面聚合酶的活性。另一方面, ,至少是相对较短的至少是相对较短的DNADNA片段片段（100-200bp100-200bp长）长）, ,两步两步PCRPCR（94 94 变性一分钟变性一分钟50-57 50-57 引物杂引物杂交交/ /延伸一分钟）能延伸一分钟）能 产生与三步产生与三步PCR

48、PCR同样多的产物。这可能是由同样多的产物。这可能是由于于TaqTaq聚合酶有很高的持续合成能力聚合酶有很高的持续合成能力, ,反应混合物在反应混合物在50-94 50-94 之间之间过渡时达到过渡时达到TaqTaq聚合酶最佳反应温度（聚合酶最佳反应温度（70-75 70-75 ）, ,在这么短的在这么短的时间内与模板退火的引物完全伸展。时间内与模板退火的引物完全伸展。2021/3/2358 这一点与快速这一点与快速PCRPCR的结果是一致的（的结果是一致的（Wittwer & Garling Wittwer & Garling 19911991）。在提高温度循环速度（降低坡道

49、时间）的尝试中）。在提高温度循环速度（降低坡道时间）的尝试中, ,研究人员采用毛细管作为研究人员采用毛细管作为PCRPCR反应容器反应容器, ,以空气作为热传导以空气作为热传导介质。用微量离心管完成介质。用微量离心管完成3030个循环的标准程序需要个循环的标准程序需要2-62-6小小时。而文献报道用快速循环仪在时。而文献报道用快速循环仪在1515分钟内完成了三步分钟内完成了三步PCRPCR的的3535个循环。快速个循环。快速PCRPCR每一个循环包括每一个循环包括94 oC94 oC变性不超过一变性不超过一秒、秒、55 oC55 oC退火不超过一秒、退火不超过一秒、72 oC72 oC延伸十秒

50、钟。除了缩短延伸十秒钟。除了缩短循环时间外循环时间外, ,快循环快循环PCRPCR扩增比用传统热循环仪完成的三步扩增比用传统热循环仪完成的三步PCRPCR更特异。目前快速更特异。目前快速PCRPCR可能限制是反映体积小（可能限制是反映体积小（10ul10ul）。）。由于体积限制只能用由于体积限制只能用50ng DNA50ng DNA作为模板。另外作为模板。另外, ,快速快速PCRPCR可可以有效的用于分析第一复杂度基因组（细菌以有效的用于分析第一复杂度基因组（细菌, ,质粒或噬菌质粒或噬菌体）和（或）均一群体。同时体）和（或）均一群体。同时, ,快速快速PCRPCR产物与热传统产物与热传统PC

51、RPCR（1X1012-5X1012 1X1012-5X1012 拷贝）一样多。拷贝）一样多。 像标准像标准PCRPCR缓冲列一样缓冲列一样, ,标准的三步标准的三步PCRPCR方式也因被视作被方式也因被视作被进一步改进的工作点。通常提高退火温度和延伸时间可以进一步改进的工作点。通常提高退火温度和延伸时间可以提高提高PCRPCR的特异性。同样的特异性。同样, ,在扩增大片段（大于在扩增大片段（大于1kb1kb）时有）时有必要延长每一步的时间以得到充分的扩增。必要延长每一步的时间以得到充分的扩增。 2021/3/2359 3 PCR3 PCR的特异性、效率和忠实性的特异性、效率和忠实性 特异性、

52、有效性和忠实性是检验特异性、有效性和忠实性是检验PCRPCR扩增效率扩增效率55的三个指标。高度特异的的三个指标。高度特异的PCRPCR反应只产生一个反应只产生一个扩增产物扩增产物, ,即预期的靶序列。扩增反应越有效即预期的靶序列。扩增反应越有效, ,经经过相对少的循环会产生更多的产物。一个非常精过相对少的循环会产生更多的产物。一个非常精确的确的PCRPCR反应产物中由反应产物中由DNADNA聚合酶诱导的错配是可聚合酶诱导的错配是可以忽略不计的。理想的以忽略不计的。理想的PCRPCR反应应该是特异、高效、反应应该是特异、高效、忠实的。研究表明这三个参数中的每一个都受忠实的。研究表明这三个参数中

53、的每一个都受PCRPCR反应的众多成分所影响反应的众多成分所影响, ,包括缓冲条件、包括缓冲条件、PCRPCR循环循环方式（温度和每一步的持续时间）以及方式（温度和每一步的持续时间）以及DNADNA聚合酶。聚合酶。遗憾的是遗憾的是, ,高特异的反应条件可能与高产量的反应高特异的反应条件可能与高产量的反应条件并不一致。同样地条件并不一致。同样地, ,高保真也可能导致低产率。高保真也可能导致低产率。因此因此, ,建立建立PCRPCR反应时反应时, ,必须清楚哪一个参数对预期必须清楚哪一个参数对预期的扩增是最重要的的扩增是最重要的, ,据此优化反应条件。据此优化反应条件。 2021/3/2360连续

54、流连续流PCR芯片的结构设计芯片的结构设计PCRPCR反应效率与反应室的比表面（表面积反应效率与反应室的比表面（表面积/ /体积比）有直接体积比）有直接的关系。为了得到高比表面的反应室的关系。为了得到高比表面的反应室, ,图图2-32-3所示的芯片结所示的芯片结构是一种热板保温式的连续流微通道构是一种热板保温式的连续流微通道PCRPCR芯片芯片77。在。在50mm50mm30mm30mm1mm1mm的硅片上刻蚀出的硅片上刻蚀出9090微米宽微米宽, ,4040微米深的微微米深的微沟道沟道, ,与另一块同样尺寸的上盖片玻璃键合在一起形成微通与另一块同样尺寸的上盖片玻璃键合在一起形成微通道反应室。

55、道反应室。 A 950C 解链解链B 770C 延伸延伸C 600C 退火退火 CABAAA2021/3/2361 解链、退火和引伸的温度依次为解链、退火和引伸的温度依次为950C950C、600C600C和和770C770C。三个。三个功能区的恒定温度由热板提供并保持。三个区域（解链、功能区的恒定温度由热板提供并保持。三个区域（解链、退火和引伸）的时间比为退火和引伸）的时间比为4:4:94:4:9, ,相应地反应液在三个区域相应地反应液在三个区域流经的路程比为流经的路程比为4:4:94:4:9（液体的流动速度一样）。但是由（液体的流动速度一样）。但是由于反应需要于反应需要, ,我们将延伸区设

56、计在芯片的中间我们将延伸区设计在芯片的中间, ,而该过程反而该过程反应时间又是最长的应时间又是最长的, ,如果再将整个区域建成一条直通道如果再将整个区域建成一条直通道, ,那那么芯片的整体尺寸将大大增加。所以为了减小芯片的长度么芯片的整体尺寸将大大增加。所以为了减小芯片的长度, ,我们将延伸区设计多流一个来回我们将延伸区设计多流一个来回, ,以略增加芯片宽度来将以略增加芯片宽度来将中间区域的长度减小为原来的中间区域的长度减小为原来的1/31/3。同理。同理, ,退火和解链区域退火和解链区域的宽度也应为其实长的的宽度也应为其实长的1/21/2。2021/3/2362 芯片设计的反应以空肠弯曲菌芯片设计的反应以空肠弯曲菌DNADNA为模板为模板, ,采用采用Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶, ,全部反应液体积为全部反应液体积为10ul10ul, ,整个反应完成需要整个反应完成需要2020个循环。反应液的流速为个循环。反应液的流速为15.6nl/s15.6nl/s, ,即为即为4.33mm/s4.33mm/s。反。反应液流经除了温度过渡区以外的整个芯片所需要的时应液流经除了温度过渡区以外的整个芯片所需要的时间为间为4 4分钟分钟, ,每个循环则为每个循环则为1212秒秒, ,那么按比例可知三个