相对荧光定量PCR的常用方法和注意事项

1、相对定量方法实际操作常用方法1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程RG6000软件设置1 1. .先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个基因的扩增效率是否一致或接近；将扩增效率优化为一致。2 2 . .同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中P1P2公式:F=2广待检样品目 待检样品看 rLL的基因平均家基因平均Ct值Ct值L 对照组目的 一基因平均Ct值对照组看家 基因平均Ct一L值IComparative Delta-delta Ct法的特点、考前须知及实际应用1) . Comparative Delta-delta

2、Ct法是很常用的一种相对定量方法，其最大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因 做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。2) .其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。3) . Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene的软件会自动给出两组标准曲 线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小丁0.1,那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta

3、 Ct法进行相对定量 分析。反之，如果M差值大丁0.1 ,就无法用该方法进行相对定量分析。此 时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小丁0.1,二是换用其它的相对定量方法。应用实例:如上图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因(Gene of Interest)和看家基因(Housekeeper Gene )做标准曲线。软件自动绘制标准曲线，并给出相应的参数。从上图可知，两组标准曲线的M值分别为-3.525和-3.467,两者的差值0.1，因此，这组看家基因和目的基因可以用Comparative Delta-delta Ct法两进行相对定量。在完成上述预实验之后，接下来就

4、可以正式对待测样品进行定量分析。在该实验中，分别对待测样品的看家基因和目的基因进行扩增， 下列图即为一个标准的扩增分析结果：NmN-STWg口Orren Cone |CopRm ClS Cl 5teHep. P5 O| Hep. Dale. Cnnc.Hep. CJP*9# P梆1HoLKjefcjeepei Gene iLlnkrcjri1即15 9S的 (14.50 JS-M-l1ncdL! %mii 2Housefc.wpei Gg AUnkiWh15.M2II Hg沥写GB A3H皿irekNpci Bene AUnknwnT&.011 1_4Ljt4cnAri1顷1G94D?

5、5 15 D9.19 73d5Unknwrti1&.52n HkMttfciimiirlSfnii1IBGHou&djpei Gene SUnknwjri17.QD7Hix姗屿潮C心167900716.62. IS 96IHOM汩knipei Bervc CUnkno*vnH&.BEJ Hyu叫匚gCUf4cF*Wi1&72咿L也uereLID强陷d Im蛔si ift.Urrtwn丞团Sfl.730.15团.35.拽词inu 用:E：mHe略111Gww d InlsSI AUrM-.MpH- Gere-NTC为进行Comparative Delta-delt

6、a Ct分析，需要对样品进行一些编辑。 简而言之, 即将目的基因和看家基因分别编辑在两页中page,并将同一样品命名成相同 名称。在该实验中，分别对三个样品A、B、C进行了分析，其中1-9号管检测了看家 基因，10-18号管检测了目的基因。可通过NEW新建一个page,并通过Selected选择每页中分析的对像。将两组 基因分别编辑在两页中，并将相同的样品命名成同一名称后，即为下列图所示：进行分析。注意：由丁没有标准品，软件无法自动给出阈值，需用手动设定，软完成两页分析之后，再进入Delta Delta CT分析界面，选择show,此时，软件 的向导界面会提示使用者一步步完成设置：样品编辑好后

7、就可进行分析工作。通过进入Analysis，分别对page1和page2Page 2:目的基因，其中10-18号管通过YES选中，样品分别命名为A、B、C,其它未选 中的样品可以不进行编辑。Page 1:看家基因，其中1-9号管通过YES选中，样品分别命名为A、B、C,其它未选 中的样品可以不进行编辑。件会提示需手动进行阈值设定，此时只要点中右侧按扭，在荧光曲线图中上下拖动光标即可由上至下，依次完成各项设置。第一项：Validation Run Performed,提示是否已验证过两个基因的扩增效率一致，可用该定量方法进行分析。选择Yes；第二项：Gene of Interest Quanti

8、tation，选中Page 1或Page 2中编辑了目的 基因的那一贞；第三项：Normaliser Quantitation，选中Page 1或Page 2中编辑了看家基因的 那一贞；第四项：Calibrator Defined，选中A、B、C三个样品中用来作为对照组的一个。完成上述四项设置之后，在窗口右侧就显示相对定量结果，如下图：Relative Quaiit- Analysis 1| H | X尾血port富 回ExportDelta Delta CT Relative Quantitation j回Validation Run Performed171 Gene of Interes

9、t Quantitation回NonnolisET Qu己ntit己Hon PI CaiibratoTDedfinued结果给出三个样品目的基因和看家基因的平均CT值，以及样品B、C中目的基因的浓度相对丁对照组A的比值。Replicate NameGCIICTNorm. CT FRelative Conl.LalibratorControl31.15E.3-YesSamplel23.5116.36291.05Sample232.0117.461.22公式：待测样品目的基因浓度待测样品看家基因浓度对照组目的基因浓度F=基因的浓度由软件根据标准曲线直接给对照组看家基因浓度出2.双标准曲线法定量流程

10、RG6000软件设置1 1. .用双标准曲线法定量时，每次每个基因都需要做目的基因和看家基因的标准曲线，必需有一组稳定的标准品。2 2 . .同一样品做标准曲线，分别对目的基因和看家基因做标准曲线，分列在两页上。P1P2分别分析P1和P2页完成分析双标准曲线法的特点、考前须知及实际应用1.双标准曲线法做相对定量分析的最大特点是，应用简便，无需像Delta-delta CT法那样对实验进行严格的优化。2.其缺乏之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。3.并且，如果用丁做标准曲线的标准品不同丁样品，比方标准品为质粒或纯化 的PCR产物，而待测样品为cDNA,那么标准曲线的扩增效率并

11、不能真实 地反映样品的扩增情况，因此以标准曲线来计算样品的实际浓度就存在一定 误差。应用实例: 在该实验中，样品管1-6为目的基因的标准曲线，7-12为看家基因的标准曲线, 待测样品A、B、C,其中15-17扩增了样品的看家基因，18-20扩增了样品的 目的基因。在用双标准曲线法做相对定量之前，同样需要对样品进行一些编辑。方法与Delta-delta CT法类似，即将所有目的基因编辑在一个page里，所有看家基因编辑在另一个page里，且相同的样品以同样名称命名。编辑完成之后即得:样品编辑好后就可进行分析工作。进入Analysis，分别对page1和page2进行分析。完成分析之后，从Othe

12、r进入，选择2 Standard Curves Relative Quantitation。根据提示向导依次完成设置。依次选中目的基因的page、看家基因的page以及对照组例，以A为对照组， 如图：Rclat ivc Quan . AnalysisPage 1:看家基因，其中7-12号管为 标准曲线，通过YES选中，15-17号 管为待测样品，分别命名为A、B、C,其它未选中的样品可不以不进行编辑。Page 2:目的基因， 其中1-6号管为标 准曲线，通过YES选中，18-20号管为 待测样品，分别命名为A、B、C,其它 未选中的样品可不以不进行编辑。结果包括计算所得的各标准品及待测样品的浓

13、度及CT值，以及样品B、C的目 的基因相对丁对照组A的浓度。3. Comparative Quantitation法定量流程(RG6000软件设置)1) .该方法并不常用，因为必需确定起始样品的总核酸浓度一致。在芯片验证时使用较多，但同样也必需有起始浓度一致的核酸样品。2) .作为常规的基因表达调控研究，建议研究者使用前两种定量方法。3) .该方法通过拐点时的循环数来进行相对定量比拟，重复性更好。4) .该方法操作非常简便，无需做标准曲线及设置内参。使用时，样品均定义为unknown，分析时选用Comparative Quantitation,确定对照组， 完成分析。应用实例：用Compara

14、tive Quantitation法进行定量分析时，在保证起始总核酸量一致的前 提下，只要对目的基因进行扩增即可，例：待测样品A、B、C,扩增目的基因。进入Analysis，在Other中选择Comparative Quantitation。上图左下方即相对表达量的结果，其中Rep.Conc为样品B、C相对丁对照组A的目的基因浓度。右侧，可通过修改Calibrator Replicate改变对照组，以获得选中后点击析结果。2StdCurves.Flel.)D dta Delfi CTQuartttaicmOlhfAll/lijc： DiwarimigligCycling FAM/Spbi (P

15、aShow即给出分reCop9,-.0512f13Gentcllilgt日M1516一EgotlAleHl：Quzmt Remit 5 - Crc:lin A.- .C XKF Quant.KEsuits Cycling. A.t，- - |JXT：1&91&7945E-011.06E*0017.617.66J5E-Q16.：35E-O117.5I国6.73E Q1CJc17J16.1IB J16.6753E-014.79E-O11&44.11E-01iCflE-QI1G1E-O1Nc |Name*Ol| ： f E ：3-ihIF-1-AUilfcrt&wrt

16、16.332AUrlcnowi15 54/jAUnfcn&wn16.01(4 BUnknowi1迥1 .5 BUnfcn&wrt16.52后BUricnQWi17 BO7CUnfcrtDwn16.79CUricnowi16昉gcUnfcn&wn16.72JJdB-ankOh Named On Al On AllOffEndP AnoilyiiECpncfntriitiQHAne A141S8u 骊| CiompaiKiw&Cone | Rep16.81.00E+00-忡邪igCalibraLoi Hftplkale| nmAverage侦骨国遂侦骨国遂17G+0.1 ?Z不同的比拟结果。在Report中同样给出拐点图和相对定量的比值结果:Take off Graph for Cyc