第一节 第二节核酸的凝胶电泳

1、核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 它是一种分析鉴定重组它是一种分析鉴定重组DNA分子及分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。技术基础。 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种从红色海藻中提取琼脂糖是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。它是一种出的线性多糖聚合物。它是一种天然聚合长链状分子，可以形成天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。小决定于琼脂糖的浓度。分为常熔点的琼脂糖和低熔点分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMPLMP

2、）琼脂糖。）琼脂糖。 1. 1. 将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于自动成像系统将电泳完毕的琼脂糖凝胶置于自动成像系统 的平台中间；的平台中间；2. 2. 开通紫外光，可见到发出荧光的开通紫外光，可见到发出荧光的DNADNA条带，在条带，在 电脑中观察图像；电脑中观察图像；3. 3. 关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图像；关上紫外光电源，在电脑中编辑和保存图像；4. 4. 根据图像判定结果。根据图像判定结果。结果分析结果分析根据标准DNA相对迁移距离推测待测定的DNA片段的大小Agarose gel electrophoresis 7 7 电泳缓冲液电泳缓冲液 常用的有常用的有TAETAE、TPET

3、PE及及TBETBE 都是常用电泳缓冲液。三者相比：都是常用电泳缓冲液。三者相比：1 1）TAETAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化；胶的阳极一侧将发生酸性化；2 2）TBETBE和和TPETPE比比TAETAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；花费稍贵，但有高得多的缓冲容量；3 3）双链线状双链线状DNADNA片段在片段在TAETAE中比在中比在TBETBE或或TPETPE中迁移快中迁移快10%10%；4 4）对于高分子质量的对于高分子质量的DNADNA，TAETAE的分辨率略高于的分辨率略高于TBETBE或或T

4、PETPE，对于低分子质量的对于低分子质量的DNADNA，TAETAE要差些。超螺旋要差些。超螺旋DNADNA在在TAETAE中的电泳分辨率要好于中的电泳分辨率要好于TBETBE。 载样缓冲液：载样缓冲液：临上样到临上样到凝胶加样孔凝胶加样孔之前与待之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。电泳的样品相混合的一种缓冲液。载样缓冲液有三个作用：载样缓冲液有三个作用：1 1）增加样品密度保证）增加样品密度保证DNADNA沉入加样孔内；沉入加样孔内；2 2）使样品带有颜色便于简化上样过程；）使样品带有颜色便于简化上样过程；3 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速

5、率向阳极迁移。率向阳极迁移。 通过染色通过染色, 紫外灯下检测。紫外灯下检测。 主要有溴化乙锭（主要有溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法和）染色法和SYBR Gold染色法。染色法。 观察琼脂糖凝胶中观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，溴化乙锭含有一个可以嵌化乙锭进行染色，溴化乙锭含有一个可以嵌DNA堆积碱基之堆积碱基之间的一个间的一个三环平面基团三环平面基团。它与。它与DNA的结合几乎没有碱基序列的结合几乎没有碱基序列特异性。特异性。 在高离子强度的饱和溶液中，大在高离子强度的饱和溶液中，大约每约每2.52.5

6、个碱基个碱基插入一个溴化乙锭插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力范德华力与上下碱基相互作用。与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与的密切接近，导致与DNADNA结合的结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。离溶液中染料有所增加。DNADNA吸吸收收254nm254nm处的紫外辐射并传递给处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收染料，而被结合的染料本身吸收302nm302nm和和366nm3

7、66nm的光辐射。这两的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的光谱红橙区的590nm590nm处重新发射处重新发射出来。由于溴化乙锭出来。由于溴化乙锭-DNA-DNA复合复合物的荧光产率比没有结合物的荧光产率比没有结合DNADNA的的染料高出染料高出20-3020-30倍，所以当凝胶中倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml0.5ug/ml）时，可以检测到少至时，可以检测到少至10ng10ng的的DNADNA条带条带。 可以用透射或入射紫外光对可以用透射或入射紫外光对EBEB染色的凝染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算

8、机观察。胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。现一般采用试剂盒回收：现一般采用试剂盒回收： 存在的主要问题：存在的主要问题：1 1 不能有效的回收大片段不能有效的回收大片段DNA DNA 2 2 不能有效回收少量不能有效回收少量DNA DNA （一）（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质聚丙烯酰胺凝胶的本质B+A-+A-B脉冲电场电泳示意图脉冲电场电泳示意图PFGE can resolve large DNA fragmentsA-+AB-+B垂直交变电场系统垂直交变电场系统场翻转系统场翻转系统箝位匀强电场系统箝位匀强电场系统旋转胶系统旋转胶系统A-+AB-+BA-+AB-+B-+核酸杂交常用几种膜的核酸杂交常用几种膜的性能比较性能比较（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组DNADNA限制片段限制