ELISA试剂及溶液配制及试验步骤

1、ELISA试剂及溶液配制包被液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）0.75g碳酸钠,1.46g碳酸氢钠，加去离子水定容至500ml。0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）0.2g磷酸二氢钾，2.90g磷酸氢二钠，8g氯化钠，加去离子水定容到 1000ml。抗体稀释液：0.02mol/L PBS（pH7.4）+0.2%BSA0.2gBSAffl配好的0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解定量至100g。封闭液：0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）+2.0%BSA2.0gBSAffl配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100g。洗涤液：0.02mol/L PBS（pH

2、7.4）+0.05%Tween-20将50ulTween-20溶入100ml0.02mol/L磷酸盐缓冲液中，震荡混 匀。显色液：TMB过氧化氢尿素溶液A液（3, 3' , 5, 5'-四甲基联苯胺，TMB）:称取TMB20m瓣于 10ml无水乙醇中，完全溶解后，加双蒸水至100ml。B液（0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0-5.4）: 称取NaHPO12HO14.34g,柠檬酸1.87g溶于180ml双蒸水，加0.75% 过氧化氢尿素1.28ml,定容至200ml,调pH至5.0-5.4。将A液和B液按1: l混合后即成TMB过氧化氢尿素应用

3、液。终止液：2mol/L H 2SO溶液10ml98麻硫酸加入60ml双蒸水中，定容至100ml,室温保存。酶标二抗：HR刖记的羊抗兔IgG ,应用时用抗体稀释液稀释3000 倍。2.2.6抗血清的分离采集血液后，去掉针头，缓慢注入已经灭菌的三角烧瓶中，待凝 固后用灭菌滴管将血液沿边缘剥离，室温放置1小时，再放入4c冰箱过夜（不能冰冻，否则产生溶血），使血清充分析出。第二天取出后 以4c3000r/min离心30min,取上清，分装后-20 C保存备用。2.2.7间接ELISA法检测家兔抗血清效价（1）抗原包被用包被液（0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，pH9.6）把抗原稀释为 0.01mg/

4、ml,将稀释好的抗原液于每个酶标板孔中加入100膜。把酶标板置入湿盒内，于4 c包被过夜。（2）洗板弃去包被液，用洗涤液加满所有酶标孔，用纱布和卫生纸包住扣 干。1次，末次将水扣干。封闭在酶联板上每孔加入250膜 封闭液（pH9.6 , 0.05mol/L碳酸 盐缓冲液含2.0%BSA）将酶联板置于湿盒内，4c孵育过夜。也可37C 孵育2h。弃去封闭液，洗涤1次同上。（5）加一抗（家兔抗血清）将免疫小鼠抗血清10屋 加到990” 的抗体稀释液中制成 1:100的抗血清。（于1.5ml的EP管中操作）。给酶标板上A行的1 号孔加100履 的1:100的血清。给酶标板上A行的2到12孔各加入 抗体

5、稀释液100 ”,然后给A组的第二孔加入100屋1:100的抗 血清，吹吸十次后吸取100 w l的血清加到第三孔，再吹吸十次取100 “加到第四孔，依次加到第12孔，最后从第十二孔中吸出100” 舍弃。这样每孔均为100屋，经过11次二倍稀释，血清稀释度为 1:204800。B、C行同上操作。给D行的前两个孔只加入100w l的抗体稀释液做为空白对照， 3-4孔加入100”稀释100倍的阴性血，5-6孔不加抗原，只用封闭 液封闭，每孔加入100”稀释100倍的抗血清作对照。加完后将酶 连板放在湿盒内37c孵育1h。(6)洗涤同上。(7)加酶标二抗各孔加入稀释倍数为1:3000的酶标二抗(羊抗兔)100“，37 C 湿盒内孵育1h。洗涤同上(9)显色每孔各加A, B液50晨 后将酶连板放入湿盒内避光 3min左右， 当阴性对照孔显蓝绿色时终止。终止时每孔加入 50”的2mol/L浓 硫