家蚕微孢子虫病检疫技术规范 编制说明

1、家蚕微孢子虫病检疫技术规范 编制说明 出入境检验检疫行业标准编制说明1 基本信息1.1 标准名称中文桑蚕微粒子病检疫技术规范英文Quarantine protocol for pebrine 1.2 与国际标准和国外先进标准一致程度情况等同修改非等效标准号?英文名称?中文名称?说明(适用于修改和非等效)1.3 任务来源批准文号 国认科 2012 36号计划编号 2012B0391.4 制(修)订情况制订修订替代的标准编号?1.5 起止时间2012年01月 2013年 12月1.6 主要起草单位浙江出入境检验检疫局1.7 主要起草人何永强、吴 姗、曹琛福、鲁兴萌、黎昊雁、帅江冰、张晓峰、朱振江、

2、戴云通、王素华、李晓军1.8 专业类别管理;动物检疫;植物检疫;食品检验;卫生检疫;化矿金;机电;轻工;纺织;包装与危化;鉴定1.9 标准体系表代码2204.3.1741.10 调整情况无2 背景情况2.1 国内外现行法律法规要求,国际贸易、疫病疫情、质量安全等检验检疫业务需求情况 桑蚕微粒子病(Pebrine)是由蚕微孢子虫(Nosema bombycis)引起的能致蚕业生产毁灭性破坏的疫病。蚕微孢子虫属原生动物界微孢子虫门、微孢子虫目、微孢子虫属,呈椭圆形,大小约为 34m×1.52m,可全身性感染蚕,在蚕卵、幼虫、茧和蛾(成虫)四个虫态中均可寄生,能经蚕卵胚胎垂直传染和食下传染

3、。病原广泛存在于病蚕、病蛹、病蛾、蚕粪、蚕尿、肠液、蚕皮、蛹皮、鳞毛以及脱落物卵壳中。 该病最早于19世纪中叶发生于法国,法国、意大利等欧洲主要养蚕国家曾因该病的暴发而导致蚕丝业的毁灭。在亚洲的日本、印度以及我国等均广泛流行,危害大,难以防治。我国近几年每年因微粒子病而淘汰的各级原种约300万张之多,直接经济损失达数亿元之巨。鉴于此,家蚕微粒子病是蚕病监控和防治的重点,在中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录中被列为二类传染病,也是目前进出境蚕唯一的检疫性疫病。我国是世界第一养蚕大国。在蚕的进出口贸易中以蚕种(卵)等生物活体的贸易为主。 蚕微孢子虫检测技术经历了肉眼鉴定、显微镜检查

4、、血清学检测和分子生物学检测方法的探索研究。由于蚕微孢子虫的独特性,血清学检测方法不理想而尚未在生产和贸易中得到有效应用。自1870年Pasteur创立母峨袋检法以来,母峨微孢子虫的光学显微镜检验方法一直应用至今,国内蚕业生产以母蛾微孢子虫检测为主。本规范引入了聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光PCR方法,PCR法是以小亚单位核糖体RNA特定基因为靶标进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。实时荧光PCR法通过检测扩增曲线,以确定样品中是否含有蚕微孢子虫核酸,可以极大地提高检测的灵敏度和特异性。我们制定桑蚕微粒子病检疫技术规程,同时兼顾到四个虫态的检疫,对保障我国蚕业生产的安全,保证我国家

5、蚕产品(蚕种等)的顺利出口,突破技术壁垒,促进外向型蚕业经济发展,为进出口检疫提供技术保障,防止桑蚕微粒子病传入和传出具有重要意义。2.2 与国内外技术法规、相关标准及其他规范性文件关系情况(适用于规程、规范类标准)国内已有相关标准如下:1、DB33/217.1-2007桑蚕种质量2、DB33/T 217.3-2007桑蚕种 第3部分:桑蚕种母蛾检疫规程3、NY 327-1997桑蚕一代杂交种检验规程4、SN/T 1660-2005出口蚕种检验检疫规程5、SN/T 2972-2011蚕检验检疫监管规程6、GB/T 20395-2006桑蚕微粒子病病原鉴定方法国内外相关文献1、陈秀,黄可威, 沈

6、中元, 王红林, 黄君霆, 等,1996.家蚕微粒子病的PCR诊断技术研究. 蚕业科学, 224:229-234.2、Dong S, Shen Z, Xu L, Zhu F,2010. Sequence and phylogenetic analysis of SSU rRNA gene of five microsporidia. Curr Microbiol. 601:30-37.3、Hatakeyama Y, Hayasaka S, 2003. A new method of pebrine inspection of silkworm egg using multiprimer PCR

7、. Journal of Invertebrate Pathology, 823:148-1515、刘吉平,曹阳,Smith JE, 徐兴耀. 2004. 模拟感染家蚕微粒子病的PCR分子诊断技术研究. 中国农业科学,3712:1925-19316、邱宝利,徐兴耀,牟志美,周 鹏, 2002. 核酸分子杂交技术鉴别和检测家蚕微孢子虫的研究.山东农业大学学报:自然科学版,33(1):14-187、张志芳,沈中元,何家禄, 2000. 微孢子虫研究进展.蚕业科学,261:38-448、陈秀,黄可威, 沈中元, 王红林, 黄君霆, 等,1996.家蚕微粒子病的PCR诊断技术研究. 蚕业科学, 224

8、:229-234.9、何永强,吴 姗,鲁兴萌,张 弘,邱海洪,帅江冰,王素华,张晓峰,徐国群,李光才,董 强,家蚕微孢子虫荧光定量PCR检测方法及诊断试剂盒,蚕业科学,2011,37(2):0260-026510、何永强,吴 姗,鲁兴萌,邱海洪,帅江冰,张晓峰,王素华,徐国群,李光才,董 强,不同DNA抽提方法对PCR和实时荧光定量PCR方法检测家蚕微孢子虫的影响,昆虫学报,2011,54(11),1329-133411、鲁兴萌,蔡顺风,邱海洪,孙文静,何永强,蚕微粒子病检测中免疫学技术的研究与应用,蚕桑通报,2011,42(3):1-412、鲁兴萌,李光才,孟祥坤,马焕艳,林宝义,楼 霞,何

9、永强,蚕微粒子病的PCR检测技术研究与应用,蚕业科学,2011,375:0878?088213、蔡顺风,何欣怡,何祥康,邱海洪,李光才,何永强,鲁兴萌,一种快速高效制备家蚕微孢子虫基因组DNA和总蛋白的方法,蚕业科学,2011,376:1019?102414、蔡顺风,何祥康,何欣怡,马焕艳,孟祥坤,邱海洪,何永强,鲁兴萌,破碎法提取家蚕微孢子虫孢子核酸的PCR 检测灵敏度试验,蚕桑通报,2011,42(4):8-11参考国家发明专利 蚕微孢子虫SYBR Green荧光定量PCR检测方法及其试剂盒和特异性引物授权发明专利号: ZL 201010272224.X 何永强,吴 姗,等一种家蚕微粒子病

10、荧光PCR检测方法及其试剂盒授权发明专利号: ZL 200910157351.2 何永强,等蚕微孢子虫、核型多角体病毒和浓核病毒的三重荧光PCR检测方法及试剂盒和引物、探针授权发明专利号: ZL 201210087285.8何永强,吴 姗,等PCR法检测蚕卵中家蚕微粒子虫的样本处理方法及检测方法授权发明专利号: ZL 201210465681.X鲁兴萌,何永强,等2.3 与国内外相关标准、文献的关系(适用于方法类标准) 现有的国内标准主要规定了有关抽样方法和显微镜检验检疫方法,少量文献涉及到血清学检测方法和普通PCR的检验方法。本标准起草小组开展了蚕微孢子虫的免疫学检测和分子生物学检测技术方法

11、的研究,并建立了相关方法,在国内外发表了10篇相关论文,获得4项国家发明专利。因此本规范保留光学显微镜检查法的基础上,引入了分子生物学检疫技术,即提取DNA,以小亚单位核糖体RNA特定基因为靶标进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,或通过荧光定量PCR检测扩增曲线,以确定样品中是否含有蚕微孢子虫核酸。 3 编制过程3.1 准备阶段(可选项)1、根据立项要求,确定编制方法,进行任务分工、拟定任务进度。2、研讨标准体例(标准属性)、标准内容、技术路线,及其与其他相关标准相比应该突破的几个关键问题。3.2 分工情况1、何永强(标准起草项目负责人):负责标准总体结构设计、标准草案、标准编制说明的

12、编写;组织中期研讨后、对标准草案的修改补充和完善;负责标准征求意见稿、标准送审稿及标准报批稿的最后把关。2、吴姗(标准主要起草人):参与“标准草案”及“标准编制说明”的编写;参与标准征求意见稿的修改与完善;参与标准送审稿及标准报批稿的编写。3、鲁兴萌:参与蚕微孢子虫显微镜检测方法和普通PCR检测方法的编写4、其他参与者:参与本标准起草过程中的讨论。3.3 标准草案(征求意见稿)编写情况(可选项)标准起草小组于2012年10月完成标准草案V1版本,通过征询专家意见,参阅其它标准和大量文献,经过对实验方法的不断验证完善,先后于2013年5月和8月,标准起草小组对V1版本进行了二次修改,形成V3版本

13、的标准草案,即标准征求意见稿。2013年9月-11月期间,根据反馈的意见,进行修改和完善,形成标准送审稿。3.4 征求意见情况(适用于送审稿)序号反馈内容/反馈单位汇总结论汇总理由汇总日期15.3部分出现“产附”,因为该名字不常见,所以在术语和定义部分应该对该名字进行定义。 福建检验检疫局 采纳已补充 2013-12-1226.1.6.1 PCR反应体系和反应参数和6.1.7.2 实时荧光PCR反应体系和反应参数应该放在正文,不应该放在附录部分。 福建检验检疫局 采纳 已修改2013-12-123蚕的中文学名一般称为“桑蚕”。建议对标准名称及内文进行修改,统一使用桑蚕。 厦门检验检疫局 采纳

14、已修改2013-12-1246.2 光学显微镜、相差显微镜是不同的概念,建议明确显微镜种类,对倍数等进行规范描述。 厦门检验检疫局 采纳已补充2013-12-1256.1 PCR和荧光PCR方法已经很成熟,主要体现在引物、探针以及样品前处理的差异,建议尽量简化描述。并将附录A的内容简化后合并到标准正文。 厦门检验检疫局 部分采纳 已经将附录A的内容放到标准的正文。但基于蚕微孢子虫结构的特殊性,其核酸提取也具有其特殊性,不宜简化。 2013-12-1264.本标准的概述部分内容不宜放在正文,建议放到资料性附录。 厦门检验检疫局 采纳 已修改 2013-12-1272.引用标准及其排序须规范,而且

15、必须在标准正文文中体现其被引用内容。否则不应列入。 厦门检验检疫局 采纳 已修改 2013-12-1281.“本标准规定了家蚕微粒子病的临床病征和实验室诊断”,“临床病征”只能描述,不能规定,建议修改。 厦门检验检疫局 采纳 已修改 2013-12-12 9标准英文名应体现“蚕”。 厦门检验检疫局 不采纳现有的标准英文名称中的“Pebrine”特指“桑蚕微粒子病”,因此不再体现蚕的英文名。2013-12-1210无意见。 陕西检验检疫局 采纳 2013-12-1211无 上海检验检疫局 采纳 2013-12-12 12标准内容丰富,既有筛查方法也有确证方法。但是撰写的位置和顺序有待优化。建议将

16、确证方法放到最前头,按重要性排序。 重庆检验检疫局 不采纳虽然光学显微镜方法为确诊方法,但该方法存在速度慢、效率低、特异性和灵敏度不高,不易区别种属等缺陷。本编制组认为,荧光PCR方法速度快、特异性和灵敏度高,可以先用来初筛,放前面,初步判为阳性者,再用确诊方法。且本标准起草小组研制的PCR法和荧光定量PCR法已经过大量实验验证,并已发表了相关文章和获得了相关专利,是一种较成熟的方法。2013-12-12 13某些提法不是很妥当。譬如核酸提取部分,6.1.3 6.1.5的内容都可以浓缩一下,建议整理为一到两段即可。6.1.3 的题目建议改为“样品采集和核酸提取” 重庆检验检疫局 部分采纳 基于

17、蚕微孢子虫结构的特殊性,其核酸提取也具有其特殊性,不宜简化。部分标题的名称已进行修改。 2013-12-1214格式上有些问题。譬如部分段间距过大,不是所有标题之前都有一个空行,建议参考相关标准进行修改。 重庆检验检疫局 采纳 已修改2013-12-1215规范性引用文件:DB33/217.1?2007 桑蚕种质量 DB33/T 217.3-2007 桑蚕种 第3部分 桑蚕种母蛾检疫规程 NY/T 327-1997 桑蚕一代杂交种检验规程、 GB/T 20395-2006 桑蚕微粒子病病原鉴定方法 SN/T 2972-2011 蚕检验检疫监管规程等内容在本标准中没有相关意义。建议去除。 广东检

18、验检疫局 采纳已修改 2013-12-1216有些段落有句号结尾,有些则没有。不符合平行段落标点一致原则。有的段落之间有空行,有些没有等等,需要通篇考虑标准的结构一致性。 广东检验检疫局 采纳 已修改 2013-12-12174 概述:建议放在附录,即资料性附录 山东检验检疫局 采纳 已修改2013-12-1218正文中分钟、min混用,建议统一替换为min 山东检验检疫局 采纳 已修改2013-12-12 19“6.1.1 试剂与材料”下,不得有悬置段,建议设为:6.1.1.1 试验所用试剂为分析纯,水应符合GB/T6682一级水要求。 山东检验检疫局 采纳 已修改2013-12-12 20

19、无意见。 江苏检验检疫局 采纳 2013-12-12 216.1.6.2条款,对样品判断结果应谨慎,因为检出的是微孢子虫核酸,并不意味就存在有感染性的活的微孢子虫。同样,6.1.7.4条款,对样品判断结果的描述也应谨慎,理由一样。 宁波检验检疫局 不采纳 目前,国内外采用的光学显微镜方法检测蚕微孢子虫,也无法区分死活及感染性。本编制组认为,蚕种进出境贸易时,也不必区分,只要确认有蚕微孢子虫存在,或检出其核酸并测序验证,就应被禁止进出境贸易。 2013-12-1222全文各平行段落应格式一致,有误悬置段一致。如3.1之后没有文字,4.1之后接着就是文字。 广东检验检疫局 部分采纳 3.1为名词解

20、释部分,设置为悬置段是标准要求的格式,因此不进行修改。其余有悬置段落的部分已经进行修改。 2013-12-123.5 审定情况(适用于报批稿)3.6 标准所达到的技术指标(适用于方法类标准)或管理目标(适用于规程、规范类标准) 适用于方法类和管理标准4 主要技术内容确定 具体见附件5 验证情况(适用于方法类标准)5.1 验证单位情况验证单位验证人员验证时间5.2 验证过程5.3 验证数据分析 5.4 验证评价 5.5 其他应说明的情况6 附加说明(可选项)6.1 宣贯标准的建议全系统范围内进行宣贯。6.2 修订和废除现行有关标准的建议无6.3作为强制性标准或推荐性的建议及主要依据建议作为推荐性

21、标准发布。6.4其他需要附加说明的情况(如社会经济效益情况)无6.5 参考文献参考文献:1、DB33/217.1-2007桑蚕种质量2、DB33/T 217.3-2007桑蚕种 第3部分:桑蚕种母蛾检疫规程3、NY 327-1997桑蚕一代杂交种检验规程4、SN/T 1660-2005出口蚕种检验检疫规程5、SN/T 2972-2011蚕检验检疫监管规程6、GB/T 20395-2006桑蚕微粒子病病原鉴定方法7、GB16548-2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程8、GB/T 18088-2000 出入境动物检疫采样国内外相关文献1、陈秀,黄可威, 沈中元, 王红林, 黄君霆, 等

22、,1996.家蚕微粒子病的PCR诊断技术研究. 蚕业科学, 224:229-234.2、Dong S, Shen Z, Xu L, Zhu F,2010. Sequence and phylogenetic analysis of SSU rRNA gene of five microsporidia. Curr Microbiol. 601:30-37.3、Hatakeyama Y, Hayasaka S, 2003. A new method of pebrine inspection of silkworm egg using multiprimer PCR. Journal of In

23、vertebrate Pathology, 823:148-1515、刘吉平,曹阳,Smith JE, 徐兴耀. 2004. 模拟感染家蚕微粒子病的PCR分子诊断技术研究. 中国农业科学,3712:1925-19316、邱宝利,徐兴耀,牟志美,周 鹏, 2002. 核酸分子杂交技术鉴别和检测家蚕微孢子虫的研究.山东农业大学学报:自然科学版,33(1):14-187、张志芳,沈中元,何家禄, 2000. 微孢子虫研究进展.蚕业科学,261:38-448、陈秀,黄可威, 沈中元, 王红林, 黄君霆, 等,1996.家蚕微粒子病的PCR诊断技术研究. 蚕业科学, 224:229-234.9、何永强,

24、吴 姗,鲁兴萌,张 弘,邱海洪,帅江冰,王素华,张晓峰,徐国群,李光才,董 强,家蚕微孢子虫荧光定量PCR检测方法及诊断试剂盒,蚕业科学,2011,37(2):0260-026510、何永强,吴 姗,鲁兴萌,邱海洪,帅江冰,张晓峰,王素华,徐国群,李光才,董 强,不同DNA抽提方法对PCR和实时荧光定量PCR方法检测家蚕微孢子虫的影响,昆虫学报,2011,54(11),1329-133411、鲁兴萌,蔡顺风,邱海洪,孙文静,何永强,蚕微粒子病检测中免疫学技术的研究与应用,蚕桑通报,2011,42(3):1-412、鲁兴萌,李光才,孟祥坤,马焕艳,林宝义,楼 霞,何永强,蚕微粒子病的PCR检测技

25、术研究与应用,蚕业科学,2011,375:0878?088213、蔡顺风,何欣怡,何祥康,邱海洪,李光才,何永强,鲁兴萌,一种快速高效制备家蚕微孢子虫基因组DNA和总蛋白的方法,蚕业科学,2011,376:1019?1024 14、蔡顺风,何祥康,何欣怡,马焕艳,孟祥坤,邱海洪,何永强,鲁兴萌,破碎法提取家蚕微孢子虫孢子核酸的PCR 检测灵敏度试验,蚕桑通报,2011,42(4):8-11联系人何永强电子邮箱hyq/0>.填表日期:2013年12月12日附件:桑蚕微粒子病检疫技术规范编制说明一、编制本标准的目的和意义 桑蚕微粒子病(Pebrine)是由蚕微孢子虫(Nosema bomby

26、cis)引起的能致蚕业生产毁灭性破坏的疫病。该病最早于19世纪中叶发生于法国,法国、意大利等欧洲主要养蚕国家曾因该病的暴发而导致蚕丝业的毁灭。在亚洲的日本、印度以及我国等均广泛流行,危害大,难以防治。我国近几年每年因微粒子病而淘汰的各级原种约300万张之多,直接经济损失达数亿元之巨。鉴于此,桑蚕微粒子病是蚕病监控和防治的重点,在中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录中被列为二类传染病,也是目前进出境蚕唯一的检疫性疫病。我国是世界第一养蚕大国。在蚕的进出口贸易中以蚕种(卵)等生物活体的贸易为主。 蚕微孢子虫检测技术经历了肉眼鉴定、显微镜检查、血清学检测和分子生物学检测方法的探索研究。

27、由于蚕微孢子虫的独特性,血清学检测方法不理想而尚未在生产和贸易中得到有效应用。自1870年Pasteur创立母峨袋检法以来,母峨微孢子虫的光学显微镜检验方法一直应用至今,国内蚕业生产以母蛾微孢子虫检测为主。本规范引入了聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光PCR方法,PCR法是以小亚单位核糖体RNA特定基因为靶标进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。实时荧光PCR法通过检测扩增曲线,以确定样品中是否含有蚕微孢子虫核酸,可以极大地提高检测的灵敏度和特异性。我们制定桑蚕微粒子病检疫技术规程,同时兼顾到四个虫态的检疫,对保障我国蚕业生产的安全,保证我国家蚕产品(蚕种等)的顺利出口,突破技术壁垒,促

28、进外向型蚕业经济发展,为进出口检疫提供技术保障,防止桑蚕微粒子病传入和传出具有重要意义。 二、任务来源 本标准是中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局和国家认证认可监督管理委员会关于下达2012年出入境检验检疫行业标准制(修)订计划项目的通知(国认科201236号)下达给浙江出入境检验检疫局和深圳出入境检验检疫局等单位起草制订的任务,标准名称为家蚕微粒子病检疫技术规范,计划编号为2012B039。根据征求意见稿相关审阅专家的意见,结合已有的相关标准的命名方法,本标准起草小组将标准名称更改为桑蚕微粒子病检疫技术规范。 编制依据 本标准草案按照GB/T1.1-2009标准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写和SN/T1255-2003出入境动物检验检疫标准编写的基本规定的要求,参考了DB33/217.1-2007桑蚕种质量、DB33/T 217.3-2007桑蚕种 第3部分:桑蚕种母蛾检疫规程、NY 327-1997桑蚕一代杂交种检验规程、SN/T 2972-2011蚕检验检疫监管规程、GB/T 20395-2006桑蚕微粒子病病原鉴定方法、 GB16548-2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程和GB/T 18088-2000 出入境动物检疫采样等标准