质粒抽提详细步骤

1、质粒提取实验步骤摇菌：先倒入锥形瓶再消毒1将配好的 LB培养液高温消毒后，放入 40C冰箱，冷却；2在酒精灯旁操作，向锥形瓶中参加100mlLB，参加 150ul 氨节看抗性;3再向锥形瓶中挑入少量菌液体：6080ul;固体：绿豆大小；4放入摇床，摇一夜。LB培养液的配方1胰化蛋白月东10g/Ltryptone2 酵母提取物5g/L yeast extract3Nacl 10g/L4 去离子水双蒸水 950ml -终体积为 1000ml5 配好后，需高温消毒纱布或报纸包质粒提取:QIAGEN plasmid Midi kit 25试剂盒准备 2 个 50mlEP 管，提 2 个质粒一共要 6

2、个 50mlEP 管。使用前考前须知：1 P1在使用前要参加 RNAase,终浓度为 100ug/ml, P1一直放 4C。2 事先溶解 P2 大冷时 P2会出现沉淀，应放 37C水浴溶解。3 预冷至 P1、P3P2作用为裂解细胞至 40C。4 提质粒前一天消毒 50ml , 20ml 管子及 2mlEP 管及 LB ,枯燥待用。5摇菌和保菌都要开酒精灯，尽量保持无菌，用酒精灯擦桌子和瓶口，不能讲话或者戴口罩。步骤:1摇菌 100ml 过夜100ml 菌分两次离心，锥形瓶中剩余的菌留作保菌用；2酒精灯旁操作，倒入 50ml 管子，6000g、15min离心力/RCF、40C配平及记得更换转 子

3、/Rootor ，离心完后弃去上清收集细菌；3用 3ml P1重悬细菌沉淀物充分溶解，沉淀可通过枪反复上下吸打混匀 -分两管离心，各加 3ml P1,后再混合为一管，保证100ml 菌液用了 3ml P1重悬。4加 3ml P2P2比拟粘稠，用之前要晃匀，充分混匀到整个液体都变蓝上下轻柔颠倒 46次，室温放置 5min 混匀时不可过猛，以免弄断genemic DNA ;裂解物是粘性的，溶解时间切勿超过 5min，一旦参加 P2就应立即将管子盖上，以防酸化 ；5参加预冷的 P33ml,立即温和的混匀至蓝色消失上下轻柔颠倒46次，放置冰上避光孵育 1520分钟 -参加 P3后，产生蓬松白色物质，沉

4、淀物变得不粘沉淀物包括 genemicDNA、蛋白质、细胞碎片、SDS;6 40C、 20000g、30min 离心，将上清液放入另一10ml 的 EP 管注意移动时不能晃，以免将沉淀转入，直接在离心室加，加完一个扔一个，注意一点沉淀都不能吸进去，吸时用双枪头，黄枪头套在蓝枪头外，减少冲击；7离心同时，用 4mlQBT润洗 QIAGEN-tip100 平衡膜，弃去脱下上液；8用 2X 10mlQC 洗 QIAGEN-tip100 两次，弃去滴下的液体注意滤膜不要枯燥，管中液体 满了就弃去，液面不要触及 TIP 下部，如果触及那么用双蒸水冲洗，参加离心后并经过萃取的上清液，萃取步骤如下列图;-

5、20000g、15min、4 C离心 - 把离心后的上清液直接加到TIP 中过滤TIP标记；9待液体差不多滤过时，用 5ml 的 QF 洗脱膜上的 DNA ,用 10mlEP 管收集洗脱物最先流出来的 34滴弃去，收集后混匀，可用摇床10min；10每管用 3.5ml 的室温异丙醇沉淀 DNA，混匀 10min,然后 40C、 15000g、离心 30min , 沉淀在管底的异丙醇沉淀物有玻璃样外观，非常松软，弃去上清时小心；11先加 1ml 的 70%乙醇洗 DNA 沉淀,移入 1.5ml 的 EP 管把沉淀打散后再移入，能不用 2mlEP 尽量不用，TIP的架子要回收，15000g离心 10分钟，倒去上液，不要触及沉淀，重 复洗一次把沉淀吹打到液体中，轻柔 ；12空气中枯燥沉淀 510分钟，待枯燥后无色透明用适宜体积 50ul的 AE 溶解沉淀 560C水浴 10min,加快溶解，放入 40C冰箱过夜；13第二天测浓度DNA ，稀释到 1ug/ul,待转染用。提质粒和保困:1将摇菌过夜后变浑浊培养基参加抗生素的锥形瓶取出，分别装到2 个 50ml的 EP 管中，离心 40C、6000g、5min。把上清液倒掉，放入一 800C 保存，等待有时间再提。2锥形瓶中剩余的菌液可以保菌，将其转入1.5m l EP,菌：甘油=7 : 3,上下颠倒混匀后一离心后