crisprcas9进行全基因组的筛选

1、-/Human CRISPR Knockout Pooled Library (Brunello)lentiCas9-Blast 质粒的基本信息：/pooled-library/broadgpp-huma n-kno ckout-br un ello/由于 cas9 自待的抗性基因是我们不需要，在抗性基因两边突变出酶切位点，酶切掉原本的抗性基因。换成另一种。TBM.342|m.MBPibal!71 - K1UIILLAI BwOI - Clai iiiJHR teal一 二一_mu - 5 |EHII : I- -:F 19rii*f (-H4XF3J

2、|AJB.3口.SV40fM a I 4L2S4- _ 1ZC2Iz針ml ClJ.SiAw-MR加利MauBI1501：.Iflhftl (IS|lentiCA9-BlatPLII：:jjw-MIMI44i(4S43Kiwi I AII|J|62：I|?154l*AwlSUd IHlSiMilTl戸11,*：、加ii Hh44le -/BA匚KBONEVKtor DKkbori*: 3 uuwCf (Sed tll Vecloi 2dtdb,d.stt)Bjckbcn* 5lz& w/o inirt (bp):13130vcibr size (b(hVctcr typa; lamri

3、dilidn Expiesson. Leultviral. CH ISPRSelectable mjrKer&ti d&UcidinGROWTH IN BACTERIAsjcterialnces)；Ampldlltr-Growtn TtmptrAture; i? CGrdwtnStbiSGrowth insiiucxions: use Sapi digest 10 cnecK foruin/anted recorrtination cf I已ntiviral p asmJ Onfamp1 n RezA- baczeia ieg St a3 .copy numlMF： nqn c

4、opy1.lentiCas9-Blast 质粒购买来时;2.试剂盒提取质粒，并测定浓度。GENE/INSERT1Gtri*/inin mrh*：castAlt rama: S p.oq&rfei CR. S-R-Cai.gSpwivs；Syntieticns*rt siz* (bp): 4200Promoter: EFS NSTagiFusion F rota in; FLAG (C terrrinii cn insert)CLONING INFORMATION FORAEN&lNSERT节Cloni ng mtThoe: TTirrnn Fnz/m? etcnlng tfte

5、: Ael, Xiiui. Are I (nDl(nli()/Cc!)caning Arts;jamHI (no: destroyed)5 sequencing pnm&r: p LU-F(5-cgg m匚3gcag agmt ica:-2 sequencing primff：(5-sc tctttc aatg ag?g:gg 2、(Com ran sequercing iJrtners)GENE/INSERT2Gen/ln5ert njinne: B ssticdin resistanceAlt naimet btlcidin 8 deniiriaseAltbsdInsert Siz

6、e (bp)l 3*勺Promoters EF5-NSCLONING INFORMATION FORGEIME/INSERT 2doniingi method: Restriction EnmeSrclicnimg shte: BamHI (ncd destroyMI)3Jcloning srtB,二匚GRI(rwL Ce&llraytJt!)5 sequencing primer: needs customi3rsequencing priitier:WPRER(Common SequeiiK.iHy Pmieisj田菌的形式存在的，先需要扩大培养。1转染前 24 h，用胰蛋白酶消化

7、对数生长期的HEK293T 细胞，调整细胞为7*105在 5ml 的 DMEM 培养基中。37C、5% CO2培养箱内培养。 待细胞密度达 70%80%时即可用于转染。2转染前 2 h 将细胞培养基更换为无血清培养基。|3向离心管中加入质粒 DNA 和等体积的 Opti-MEM，混匀，调整总体积为2.5 ml，在室温下温育 5 分钟。4将 Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取 100 卩 l Lipofectamine 2000 试剂在另一管中与 2.4 ml Opti-MEM 混合，在室温下温育 5 分钟。5 把稀释后的 DNA 与稀释后的 Lipofectamine 200

8、0 进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在 5 分钟之内混合。6 混合后，在室温下温育 20 分钟，以便形成 DNA 与 Lipofectamine 2000 稀慢病毒包装质粒-/释液的转染复合物。-/7 DNA 与 Lipofectamine 2000 混合液转移至 293T 细胞的培养液中，混匀,于 37C, 5% CO2细胞培养箱中培养。培养 8 h 后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入 20 ml 的 PBS 液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。9 每瓶细胞中加入含 10% 血清的细胞培养基 25 ml，于 37C、5% CO2培养箱内继续培养 48

9、小时。10 收集转染后 48 小时（转染即可为 0 小时计起）的 293T 细胞上清液。11 于 4C, 4000 g 离心 10 min，除去细胞碎片。12 以 0.45 卩诫滤器过滤上清液于 15ml 离心管中。、 慢病毒转染细胞参考网址： /protocols/ge nerat in g-stable-cell-li nes/1. 取六孔板铺 50000 个细胞，37 C,5% CO2 培养，待细胞长到 70%，换含有8ug/mlpolybrene 的培养基培养。2. 慢病毒悬液用含有 10ug/ml 的 DMEM 培养基稀释。1 Dikitio

10、nVolumi of Lntivirus (pL)VDlum* of DMEM complete + 10 yg/mLpolybrvne (pl)00soa3002001：10ISO3501：&0904701:100151 S0034973. 六孔板中每个空加一种浓度的病毒稀释液，每空0.5ml。4. 孵育 4872 小时。5. 换成含有适宜浓度的抗生素的培养基培养1.5ml ,筛选出转染成功的细胞。 抗生素浓度的摸索：用培养基稀释抗生素为 1ug/ml、 2ug/ml、 3 ug/ml、 4 ug/ml、 5 ug/ml、 6 ug/ml、 7 ug/ml、8 ug/ml、9 ug/

11、ml、10 ug/ml，并用稀释后的浓度培养细胞， 35 天内使所 有细胞死亡的最低浓度可用于筛选细胞。*DM EM hign glucose*L-al anykL-g lutam re 0 r alternative stablegkJiamne)-Hea? Inactivate dFBS*Pol/tirene*P3S pH11 Aibout cakium or nragnesium (cationscan affecl:he attachments adherent加忙！* MicrocentriLgetuces&wel dfehesPipesesPipetieTitarcd le

12、rcivin怡comaining your sequence ointerest-/6持续加药筛选直到细胞不再大量，并能稳定表达 Cas9。一般筛选需要 12 个Forward Primer: dCas9-F2 CCAAAGAGGTGCTGGACG五、lentiGuide-Puro 骨架基本信息UTspMIKmalituAl VipMI Gil|Ma- Swiilipis$ on Lenth-irLCRISPR9#lectabl# markers: urorr /c nGROWTH IN BACTERIA怯nl5)1Amp rill nGrowth Ttmptraturt. 37rCGrowt

13、h sirain) )i5 stutricirg primtr hX-F3 saquanclng primsr: fiSa.a4-iev (f-A11 GT GGA1JAA TAG T GCO3)(CORmen tecnirin PranprsjGENE/IMSERT2G*n#；ln?rt nam*! Puromi cm resBianoeAH nam:DIMOI-.Lin N-acebl-trarsfrra5eAN rme；-/5 uglentiCIRISPRv2 or lentiGuide-Puro3ulFastDigestBOTBI(Fermentas)3 ulFastAP (Femne

14、ntas)6 ul10X FastDigest Buffer0.6 ul100 mM DTT (freshly prepared)X ulddH9060 ultotal2,试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)纯化酶切的质粒，并用EB 或 ddH2O 溶解。3,sgRNA1 和 sgRNA2 用 T4 链接酶连接。1 ulOligo 1 (100 pM)1 ulOligo 2 (100 uU)1 ul10X T4 Ligation Buffer (NEB)6 5ddH2O0.5 ulT4 PNK (NEB M0201S)10 ultotal反应程序:37C30 min

15、95cC 5 min and then ramp down to 25C at5C/min5,把第三步的产物用无菌水或EB 以 1 : 200 的比例稀释。6,质粒与 sgRNA 的连接整合， 温室放置10min。Xul1 ul5 ulX uldigested plasmidfrom Step 2 (50ng) diluted oligoduplex from Step 4 2X QuickLigase Buffer (NEB) ddHiO10 ulsubtotal1 ulQuick Ligase (NEB JVI2200S)11 ultotal7.异丙醇沉淀核酸，75%乙醇洗涤后，晾干，用

16、ddH2O 溶解。8.测质粒 DNA 的浓度。八、 sgRNA 文库的扩增/cms/filer public/56/71/5671c68a-1463-4ec8-9db5-7 质粒转试剂:61fae99265d/broadgpp-pdna-library-amplification .pdf厅化电感细胞100(1 L electrocompete nt cells (STBL4TM, Thermo Fisher Scie ntific, 11635-018)400 ng library plasmid DNA? 4 electroporation

17、cuvettes (0.1 cm gap, Bio-Rad, 165-2089)-/? 10 mL SOC (1X SOC, New England BioLabs, B9020S)? 4 bioassay plates (500 cm2,LB agar + an tibiotic)? 2 Maxi-preps (Qiagen HiSpeed Maxi, 12663)? Biospreader (Bacti Cell Spreader, VWR International, 60828-684)? Electroporator (MicroPulserTM, Bio-Rad, 16521001

18、.37 度预热 SOC 培养基 15min 和含有 100ug/mlAMP 的 LB 培养基。2.取电转化感受态细胞于冰上解冻，标准质粒也置于冰上，同时准备干净的电击杯 于冰上预冷。3.取 400ng 的质粒加入 100ul 的电感细胞中，充分混匀。4.取 25ul 混合液把电击杯放在电击仪上进行电击(1.8kv )。5.迅速在电击杯中加入 1ml SOC 培养液(无抗生素)，然后充分混匀，移到 15ml 的 离心管中.6.重复 3 次，增加 SOC 培养基到 10ml。7.取两空离心管，分别加入5ml 上述混合液。8.37 度放置 1h。9.取 10ul 的混合物做 4 个浓度梯度，每个稀释

19、10 倍。10.每个浓度(稀释 103、104、105、106)取 10ul 涂布于含有 100ug/mlAmp 的 LB 培养基。11 .倒置培养皿，37C培养 16 18 小时。12 .计算电转的效率，菌落数*稀释倍数*电感细胞数。13 .第二天刮取菌落接种 含有 50mlLB 和 100ug/ml Amp 培养基的锥形瓶培养，摇床37 度培养过夜。九、检测扩增的质粒1.用试剂盒提取质粒，按说明书操作。并测浓度。2.双酶切质粒3.用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，分析电泳后的条带的大小。十、慢病毒包装质粒1转染前 24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T 细胞，以含 10%血清的培养基调整细

20、胞密度为 1.2 x 107细胞/20 ml，重新接种于 15 cm 细胞培养皿，37C、5% CO2 培养箱内培养。24 h 待细胞密度达 70%80%时即可用于转染2转染前 2 h 将细胞培养基更换为无血清培养基。3向离心管中加入质粒 DNA 和等体积的 Opti-MEM，混匀，调整总体积为2.5 ml ,在室温下温育 5 分钟。4将 Lipofectamine 2000 试剂轻柔摇匀，取 100 卩 l Lipofectamine 2000 试剂在另一 管中与6混合后，在室温下温育 20 分钟，以便形成 DNA 与 Lipofectamine 2000 稀释液的-/2.4 ml Opti

21、-MEM 混合，在室温下温育 5 分钟。5把稀释后的 DNA 与稀释后的 Lipofectamine 2000 进行混合，轻轻地颠倒混匀，不 要振荡。必须在 5 分钟之内混合。-/转染复合物。DNA 与 Lipofectamine 2000 混合液转移至 293T 细胞的培养液中，混匀，于 37C,5% CO2 细胞培养箱中培养。培养 8 h 后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml 的 PBS 液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。每瓶细胞中加入含 10%血清的细胞培养基 25 ml，于 37C、5% CO2 培养箱内继续培养 48 小时。收集转染后 48

22、小时(转染即可为 0 小时计起)的 293T 细胞上清液。于 4C,4000 g 离心 10 min，除去细胞碎片。以 0.45ym滤器过滤上清液于离心管中。或者：用 ddH2O 溶解 50mg 的 PEI，调 PH 为 7.1，定容到 50ml。转染前 24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293T 细胞，调整细胞为 1.8*107在 45ml 的 DMEM 培养基中。37C、5% CO2 培养箱内培养。取一个 50ml 离心管混合以下物质：ComponentAmount per T225 flaskFinal ConcentrationDMEM serum free)651 plpMD

23、2.G (Leritr/iral helper plasmid)工*gg5.2阿mb1psPAX? (lentiviral helper plasmid)6.8 gg10,4 pg ml-1Lentiviral tanget plasmidpg20.9 pg ml-1加入 195ul 的 PEI 试剂，常温放置10min。再加入 25mlDMEM。跟换新的培养基48h 后收集上清，0.45 yn 滤器过滤上清液于离心管中。慢病毒文库转染模式细胞并进行基因筛选1.测定最适的 MOI(1) .测定前一天，取 6 孔板，每个孔加 4X10 个细胞，和 2ml 含有 8ug/ml dpolybrene 的培养基。(2) .测定病毒的浓度，准备 710 个无菌的 Ep 管。在每个管中加入 90yl的无血清培养基。(3) .取待测定的病毒原液 10y加入到第一个管中，混匀后，取 10y加 入到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。(4) .六孔板的每孔吸取 90y培养基丢弃。加入 90y稀释好的病毒溶液。 放入培养箱培养。(5) . 24 小时后，换成完全培养基 2ml。小心操作，不要吹起细胞。(