神经氨酸酶抑制实验、动物接种及组织中病毒的定量

1、1.不悔梦归处，只恨太匆匆。2.有些人错过了，永远无法在回到从前;有些人即使遇到了，永远都无法在一起，这些都是一种刻骨铭心的痛!3.每一个人都有青春，每一个青春都有一个故事，每个故事都有一个遗憾，每个遗憾都有它的青春美。4.方茴说：“可能人总有点什么事，是想忘也忘不了的。 ”5.方茴说：“那时候我们不说爱，爱是多么遥远、多么沉重的字眼啊。我们只说喜欢，就算喜欢也是偷偷摸摸的。”6.方茴说：“我觉得之所以说相见不如怀念，是因为相见只能让人在现实面前无奈地哀悼伤痛，而怀念却可以把已经注定的谎言变成童话。7.在村头有一截巨大的雷击木，直径十几米，此时主干上唯一的柳条已经在朝霞中掩去了莹光，变得普普通

2、通了。8.这些孩子都很活泼与好动，即便吃饭时也都不太老实，不少人抱着陶碗从自家出来，凑到了一起。9.石村周围草木丰茂，猛兽众多，可守着大山，村人的食物相对来说却算不上丰盛，只是一些粗麦饼、野果以及孩子们碗中少量的肉食。神经氨酸酶抑制实验、动物接种及组织中病毒的定量樊玉磊?一、神经氨酸酶抑制试验（NI test）实验原理：NA与胎球蛋白作用可释放出唾液酸，亚砷酸钠溶液可以终 止唾液酸酶的活性，硫代巴比妥酸溶液与游离的唾液酸以一定比例结 合可以产生粉红色。实验步骤：1.依次在1-9的试管中加入10倍稀释的N1N9亚型的血清25匕I,第10管加入25卩I ND血清做对照。（做两排）2.把尿囊液用PB

3、S做10X,100X稀释，分别加入2排试管中，每管加 入25卩I。3.用Para膜封盖管口，37TC作用一小时。4.然后加入Fetuin溶液（冰冻化开的）50卩I,37?C作用2小时或过夜。（最好过夜）5.再加入过碘酸钠溶液50卩l，振荡，室温下静置20分钟。6.加入亚砷酸盐溶液500卩l，并振荡至颜色消失。7.再加入硫代巴比妥酸溶液（TBA）1.25mI,并振荡。8.沸水中煮15分钟,观察结果。9.判定： 粉红色表明抗血清无抑制作用； 无色者表明血清有抑制作用,由此判定亚型。溶液配制：1. PB, pH 5.9A. 0.4 M 磷酸二氢钠（NaH2PO4）:称 27.6 g NaH2PO4溶

4、于 500 ml 去离子水中。B. 0.4M 磷酸氢二钠（ Na2HPO4）: 称 28.4 g Na2HPO4溶于 500 mI 去离子水中。1.“噢,居然有土龙肉,给我一块！ ”2.老人们都笑了,自巨石上起身。而那些身材健壮如虎的成年人则是一阵笑骂,数落着自己的孩子,拎着骨棒与阔剑也快步向自家中走去。3.石村不是很大,男女老少加起来能有三百多人,屋子都是巨石砌成的,简朴而自然。4.在村头有一截巨大的雷击木,直径十几米,此时主干上唯一的柳条已经在朝霞中掩去了莹光,变得普普通通了。5.这些孩子都很活泼与好动,即便吃饭时也都不太老实,不少人抱着陶碗从自家出来,凑到了一起。6.石村周围草木丰茂,猛

5、兽众多,可守着大山,村人的食物相对来说却算不上丰盛,只是一些粗麦饼、野果以及孩子们碗中少量的肉食。1.不悔悔梦归处，只恨太匆匆。2.有些人错过了，永远无法在回到从前；有些人即使遇到了，永远都无法在一起，这些都是一种刻骨铭心的痛！3.每一个人都有青春，每一个青春都有一个故事，每个故事都有一个遗憾，每个遗憾都有它的青春美。4.方茴说：可能人总有点什么事，是想忘也忘不了的。 ”5.方茴说：“那时候我们不说爱，爱是多么遥远、多么沉重的字眼啊。我们只说喜欢，就算喜欢也是偷偷摸摸的。”6.方茴说：我觉得之所以说相见不如怀念，是因为相见只能让人在现实面前无奈地哀悼伤痛，而怀念却可以把已经注定的谎言变成童话。

6、”7.在村头有一截巨大的雷击木，直径十几米，此时主干上唯一的柳条已经在朝霞中掩去了莹光，变得普普通通了。8.这些孩子都很活泼与好动，即便吃饭时也都不太老实，不少人抱着陶碗从自家出来，凑到了一起。9.石村周围草木丰茂，猛兽众多，可守着大山，村人的食物相对来说却算不上丰盛，只是一些粗麦饼、野果以及孩子们碗中少量的肉食。取 81 ml 溶液 A，19 ml 溶液 B 混匀配成 0.4 M buffer ，pH 5.9。室温保存。2.胎球蛋白（Fetuin ）:胎球蛋白 0.5g，PB，pH 5.9 20 ml，去离子水 20 ml ;分装成 5ml，-20 ?C 保 存。3.过碘酸盐溶液：过碘酸钠

7、4.28 g，去离子水 38 ml，加热溶解，室温冷却后 62ml 85 %正磷酸混匀，室 温避光保存。4.亚砷酸盐溶液：亚砷酸钠10.0 g，无水硫酸钠 7.1 g，去离子水 100 ml，加热溶解，室温冷却后加0.3 ml 浓硫酸，室温保存。5.硫代巴比妥酸溶液：无水硫酸钠 14.2 g，硫代巴比妥酸 1.2 g，去离子水 200 ml ，沸水中加热溶解，室温保存。据硫代巴比妥酸的质量，一般配好10 天后溶液中岀现沉淀。因此，该溶液要在使用前配制。6. PBS （ 0.01 M ），pH 7.3 :氯化钠（NaCl ） 80.0 g，氯化钾（KCl） 2.0 g，磷酸氢二钠（NazHPOq

8、）11.5 g，磷酸二氢钾（KH2PO4 ） 2.0 g，去离子水 10 L。1. 实验中的硫代巴比妥酸要新鲜配制，过碘酸钠配好后要放在棕色瓶中保存。2. 血清和尿囊液都要作适当稀释，一般血清作 10 x稀释，尿囊液稀释 10X。3. 第一步和第二步后要用封口膜封住管口放入温箱作用1 小时，加入胎球蛋白后用封口膜封住管口放入温箱过夜。4. 作实验时一定仔细认真，避免加错管或者多加和稍加。5. 需要振荡时，一定要振荡充分。6. 实验所用的毒株的血凝价要足够高易出结果。二、半数感染量试验?1.将病毒原液作10倍递进稀释，从10-1稀释到10-10。稀释液用加双抗 处理得灭菌生理盐水。?2.从10-

9、4得稀释度开始接种，10-410-10得每个稀释度接种5个鸡胚， 每个胚接种0.1ml。然后，将接种好得鸡胚放入35C温箱中孵育两天。 接种时避免交叉污染。?3.将鸡胚放入冰箱中过夜，然后收取尿囊液，并对其血凝价进行测定, 将试验结果记入下表。病毒感染感染数未感染数累计稀释比例感染数未感染数感染比例感染率-4105/55022022/22100-5105/55017017/171001.“噢，居然有土龙肉，给我一块！ ”2.老人们都笑了，自巨石上起身。而那些身材健壮如虎的成年人则是一阵笑骂，数落着自己的孩子，拎着骨棒与阔剑也快步向自家中走去。3.石村不是很大，男女老少加起来能有三百多人，屋子都

10、是巨石砌成的，简朴而自然。4.在村头有一截巨大的雷击木，直径十几米，此时主干上唯一的柳条已经在朝霞中掩去了莹光，变得普普通通了。5.这些孩子都很活泼与好动，即便吃饭时也都不太老实，不少人抱着陶碗从自家出来，凑到了一起。6.石村周围草木丰茂，猛兽众多，可守着大山，村人的食物相对来说却算不上丰盛，只是一些粗麦饼、野果以及孩子们碗中少量的肉食。1.不悔悔梦归处，只恨太匆匆。2.有些人错过了，永远无法在回到从前；有些人即使遇到了，永远都无法在一起，这些都是一种刻骨铭心的痛！3.每一个人都有青春，每一个青春都有一个故事，每个故事都有一个遗憾，每个遗憾都有它的青春美。4.方茴说：可能人总有点什么事，是想忘

11、也忘不了的。”5.方茴说：“那时候我们不说爱，爱是多么遥远、多么沉重的字眼啊。我们只说喜欢，就算喜欢也是偷偷摸摸的。”6.方茴说：我觉得之所以说相见不如怀念，是因为相见只能让人在现实面前无奈地哀悼伤痛，而怀念却可以把已经注定的谎言变成童话。7.在村头有一截巨大的雷击木，直径十几米，此时主干上唯一的柳条已经在朝霞中掩去了莹光，变得普普通通了。8.这些孩子都很活泼与好动，即便吃饭时也都不太老实，不少人抱着陶碗从自家出来，凑到了一起。9.石村周围草木丰茂，猛兽众多，可守着大山，村人的食物相对来说却算不上丰盛，只是一些粗麦饼、野果以及孩子们碗中少量的肉食。10-64/54112112/1392.310

12、-74/541828/1080-8103/532444/850-9101/514171/714.2. C-10100/5050110/110?按ReedMuench法公式计算半数感染量：?ID50=高于50%病毒稀释度对数-相应距离比X稀释系数的对数（10倍递进稀释的为1）?相应距离比=（高于50%-50%）宁（高于50%-低于50%）三、动物接种通过滴鼻，静脉接种，皮下接种等每只鸡接种200卩l 107EID50的病 毒尿囊液。1. 考虑清楚选择那种接种途径，接种过程在超净台内进行2. 接种前查阅文献确定接种剂量，对接种病原进行量的测定后接种。3. 动物实验过程中要防止污染，随时消毒。4.

13、注意观察动物的临床症状，饮食，饮水，呼吸，精神，粪便等等有无异常。四、组织中流感病毒的定量1.在接种流感病毒后宰杀动物，并取其气管，肺，肝，脾，脑，肾，法氏囊，肠，血液，肌肉，于-80C保存。2.将采取的脏器组织样品研磨制成10%乳剂，分装在3个1.5 mlEppendof管里。首先用一管做HA试验来筛选阳性样品，其余的保存 在-80C冰箱。取0.1 ml乳剂接种10日龄SPF鸡胚中，35C孵育48小时，弃去24小时之内死亡的鸡胚，在无菌条件下收取尿囊液，测定 尿囊液的血凝价。若有血凝价，测定组织中病毒的半数感染量。3.根据组织中病毒的血凝价设置稀释度，如果组织中病毒的血凝价在 24以下，组织

14、 乳剂就稀释 2-3 倍，如果组织中病毒的血凝价在 24以上，组织乳剂就稀释 46 倍。（强 毒时感染量一般都在 107,8左右，弱毒一般在 103左右）取 0.1 ml 乳剂接种 10 日龄 SPF 鸡胚，每个稀释度接种 5 枚鸡胚，35C孵育 48 小时，弃去24 小时之内死亡的鸡胚，在无菌条件下收取尿囊液， 测定尿囊液的血凝价。 按 Reed-Muench法定量脏器组织1.“噢，居然有土龙肉，给我一块！ ”2.老人们都笑了，自巨石上起身。而那些身材健壮如虎的成年人则是一阵笑骂，数落着自己的孩子，拎着骨棒与阔剑也快步向自家中走去。3.石村不是很大，男女老少加起来能有三百多人，屋子都是巨石砌

15、成的，简朴而自然。4.在村头有一截巨大的雷击木，直径十几米，此时主干上唯一的柳条已经在朝霞中掩去了莹光，变得普普通通了。5.这些孩子都很活泼与好动，即便吃饭时也都不太老实，不少人抱着陶碗从自家出来，凑到了一起。6.石村周围草木丰茂，猛兽众多，可守着大山，村人的食物相对来说却算不上丰盛，只是一些粗麦饼、野果以及孩子们碗中少量的肉食。1.不悔梦归处，只恨太匆匆。2.有些人错过了，永远无法在回到从前;有些人即使遇到了，永远都无法在一起，这些都是一种刻骨铭心的痛!3.每一个人都有青春，每一个青春都有一个故事，每个故事都有一个遗憾，每个遗憾都有它的青春美。4.方茴说：“可能人总有点什么事，是想忘也忘不了

16、的。 ”5.方茴说：“那时候我们不说爱，爱是多么遥远、多么沉重的字眼啊。我们只说喜欢，就算喜欢也是偷偷摸摸的。”6.方茴说：“我觉得之所以说相见不如怀念，是因为相见只能让人在现实面前无奈地哀悼伤痛，而怀念却可以把已经注定的谎言变成童话。7.在村头有一截巨大的雷击木，直径十几米，此时主干上唯一的柳条已经在朝霞中掩去了莹光，变得普普通通了。8.这些孩子都很活泼与好动，即便吃饭时也都不太老实，不少人抱着陶碗从自家出来，凑到了一起。9.石村周围草木丰茂，猛兽众多，可守着大山，村人的食物相对来说却算不上丰盛，只是一些粗麦饼、野果以及孩子们碗中少量的肉食。的病毒含量?乳剂是 10%的，接种到鸡胚时是 0，1 毫升。这样算它们的感染量 时就是 100 倍开始 的。?在第一次做 时如果没有把握 时，可以把乳 剂样品分成 3 各部分，防止失败时没有 样品。?接种流感病毒的 组织 除呼吸器官以外，内 脏里的肝，肾脏，脾脏的感染价位也可1.“噢，居然有土龙肉，给我一块！