Snapshot技术平台中文

1、Snapshot技术平台SnaPshot技术平台是Applied Biosystems,ABI公司推出了专为检测SNP设计的分析软件和试剂盒可对多个SNP位点同时进行基因分型也被称为minisequencing 。该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot反应后，产物通过电泳分离、五色荧光检测、Gene mapper分析，可在 一次电泳胶 内检测 多个SNP位点。这个平台是建立在3730,3130等PCR测序仪上的技术。3730XL型DNA序列检测仪一.？ SnaPshoE：作原理应用SNaPshot进行定点的序列分析，其基本原理遵循了DNA直接测序中的双脱氧终止法，所不同的是

2、PCR反应中只有不同荧光标记的ddNTP。由于每个 SNP位点的引物3'端都紧靠SNP点，因此每一种引物在聚合酶作用下，根据模板的的序列，只延伸一个核甘酸。然后用先进的荧光检测系统，检测延伸的那个核甘酸的种类。1 .多重SNaPshot反应的工作原理：在一个SNaPshot反应体系中，针对每个待测 SNP位点 在其上游或下游设计一条单向的寡核甘酸引物（正向引物或反向引物），引物的Tm值要求在50度以上，在AmpliTaq聚合酶和4种不同荧光标.记的ddNTP存在的情况下，各条 引物与各自互补的 DNA模板Z合，聚合酶在引物的3'末端延伸单个碱基反应即告终止，产物的长度为引物长度

3、 +1bp。延伸的碱基就是该样本在该位点上的基因型，其中纯合子表现为单峰，杂合子表现为双峰。为了能够分辨不同 SNP的不同基因型，可在引物的5'末端加上不同长度的 Poly C或Poly T,使各条引物以长度区分。经电泳将其分开。最短的引物一般设定为20bp,相邻两个SNP的引物之间长度一般相差4-6个核甘酸，以便区分。 多重SNaPshot反应即利用引物间长度的差异和单碱基延伸4种荧光标记的ddNTP而最终达到区分不同SNP位点的作用,一次反应可以同时对 4-5个SNP进行基因分型,是一种通 量较高的基因分型的方法。图1 SnaPshot实验原理图解2 .多重SNaPshot反应的工

4、作通量工作的进度取决于多重PCR和EXTENSION的条件优化过程。还有测序仪的通量也是很重要的，3730每天可以做16次96道电泳，如果每次出 4个位点，那每天的通量就是 6000个 GENOTYPING ,是中等通量的检测。二.？ SnaPshoE：作流程1 .引物的设计SNAPSHOT可以检测多重的 SNP,我们一般选择 4 5个位点做一个组合。现对这些目的 SNP进行引物的设计。每个 SNP设计3条引物，其中2条是目的片段的扩增，长度在200500bp左右，Tm值在60度左右。第3条的引物的是延伸 ddNTP,设计在SNP位点的上游 或者是反向的下游。引物设计注意事项：1. 同一反应管

5、中，不同位点的引物长度必须不同，最好能相差4-6个碱基。2. 引物与模板互补部分(有效引物)的Tm值至少要50 Co3. 为了改变引物的长度，区分不同的位点，可以在引物的5'端力口 poly(dT)、poly(dA)、poly(dC)或者poly(dGACT)尾巴。这四种尾巴理论上不容易形成二级结构，并且 都经过实验验证。小心：poly(dT)有可能与真核基因 3'端的poly(dA)尾巴互补。4. 引物在毛细管中的迁移受引物长度、碱基组成、标记的荧光染料等因素影响。引物越短，影响越显着，越有可能偏离仅仅根据片段长度预期的引物迁移距离。当引物长度小于 36个碱基时，ABI强烈建

6、议用户使用 Primer Focus试剂盒做预 实验，确定各种引物在多重电泳中的精确迁移距离。5. 合成长度大于30个碱基的引物时，建议采用HPLC方法纯化。6.在引物设计的时候，如果 +链DNA的序列不理想，难以设计出最佳引物，请使 用-链DNA设计引物。进行多重SNaPshot反应时，需多条引物和多个模板同时进行。为了保持反应的一致性，对引物的设计要求是尽量保持相近的Tm值，否则会引起非特异性产物的扩增，造成碱基误读。另外,反应混合液中不同模板和其对应引物的量还应选择合适比例。与单重SNaPshot反应相比，多重反应不但节省了反应时间，还大大减少了试剂用量，降低了反应成本。位点SNPPCR

7、 LEFT PRIMERTMPCR RIGHT PRIMERTM长度SNP1c/tGAGCCAGAGGAGGATGTGAGGCTAGAAGGAGCGAGGACT248SNP2C/TACGTTGCAGTTGCCIIICTTGACTCTGCAGTGAGGC:CTA210SNP3A/GCCTTGATACCACGTGCATTGTTCTTCAGCCTCTGCCAm185SNP4C/GTCAAGCCCAGTCCIIICIGTCCCAATAGCCGTATCTGGAA296位点延伸引物TM方向产物长度Nts addedSNP1CGATCATAGTCAGCTGGCCTR20A/GSNP2cccccccc-GGC

8、ACGGTACCTGGGCTL25C/TSNP3cccccccc-TCATCAATTGCTGAGGACAGAGL30A/GSNP4ccccccccccccc-AACTCTGGGAGATTCTCCTAIIGACL38C/G2.片段扩增引物稀释，将2OD的引物稀释到100mM.加入的TE的量为660000/MW如分子量为7003,则加入660000/7003=做试验前将一组的引物加 DDH2O稀释成10mM.反应体系：10 汨uffer (15Mm Mg 2 )1 LPrimer (10Mm)0.4 LdNTP(10Mm)0.3 LHotStar (5u/ul)0.1 LDNA1 LMg2+ (2

9、5Mm)0.52 LddH2O6.68 LTotal Volume10 L多重PCR反应采用Touch-down的PCR反应程序：95 C 15 min;94 C40 s, 63 C 1 min 每个循环下降 0.5 C ,72 C min,1 5 个循环；94 C40 s,56 C40 s,72 C min, 25 个循环；72 C8 min;结束后4 C保存。PC*物经琼脂糖电泳检测有片段的表明实验成功。多重PCR产物凝胶电泳1234 Marker 12343. PCR产物的纯化多色SNP实验的模板 DNA可以是质粒，也可以是 PCR产物到pmol)。质粒可以直接用于 反应，但PCR产物必

10、须先作好纯化， SAP酶将残余dNTPs去磷酸化,ExoI降解游离单链引 物。(1)纯化酶：SAP 和 Exo I(2)作用原理：SAP 去除多余的dNTP和弓I物Exo I去除单链引物和其他单链DNA产物(3)反应体系：PCR产物6 L+2 L酶混合液(含2U SA对2U ExoI),振荡混匀(4)反应条件：37 C孵育保温1 hr,然后75 C保温15 min以灭活SAP和Exo I 酶。纯化好的模板可以在4 C保存24 hr或-20 C长期保存。4. SNaPshot PCR混合模板： 如果以PCR产物作为SNaPshot PCR的模板，在纯化好后，每种各取2 L,混合。混合SNaPsh

11、ot的PCR引物：每种引物在反应体系中的终浓度分别为M。混合SNaPsho的PCR弓I物：每种引物在反应体系中的终浓度分别为 0.2 M。(每个SNP弓|物加1-2ul到500ulDDH2O中)SNaPshot PCR用量 (L / Sample)fe准品(L)Reaction Mix5Pooled PCR Products 22Pooled Primers1dH2O25 L10 LPCR循环条件为：96 C 10 sec (96 C 10 sec 50 C(53 C)5 sec 60 C 30 sec) 25 循环 60 C 30 sec4 C5. SNaPshot PCR产物的纯化在5 L

12、上述SNaPshot PCR产物中加入或者 1 U CIP ,震荡混匀，37 C 保温1 hr, 75 C保温15 min以灭活酶，4 C可保存24 hr或-20 C长期保存。6. 310、3100、3730电泳样品制备试 剂用量（L）Hi-Di FormamideGS-120 LIZSNaPsho 产物1总体积L95 C变性5 min 迅速冰冷4 min。每个电泳样本都加入了LIZ -120内标，使延伸片段的长度大小可以精确定位。15U20L -jI25 3, 3506211111 J1301020i*制:图2, liz-120分子内标电泳峰形7. 软件分析uJG 白？晔.3)1|JR L-it|JMikM! tA . Barvhd.'Ea rn电iu图3.不同样本多重SNAPSHOT电泳结果图4. 1个SNP位点的不同样本的基因型结果，G/A,AA,GG软件分析后输出数据结果Sample NameMarkerAllele 1Allele 2LH005RS1010GLH006RS1010GALH007RS1010ALH009RS1010GALH010RS1010GALH012RS1010GLH014RS1010GALH017RS1010G