革兰氏染色原理

1、一、染色原理与方法（ 1） 染 色 原 理由于微生物细胞含有 大 量 水分 ，机 体 是 无 色 透明 的 ，与 周围背景没有明显的反差，必 须 进 行染 色 ，使 经 染 色 后的 菌 体 与 背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。微生物中细菌、致病菌是很小的生物体，必须通过染色的方法， 在 显 微镜 下才 能 看 得 清 楚，并 且 还可 以 通 过 染 色的 方法 鉴 别 革 兰 氏染色特性，以及是否长有鞭毛、周毛、荚膜和芽孢等。（ 2） 染 色 方 法简单染色法简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色， 观察细菌的形态。复染色法用两种 或多 种染料染 细菌

2、 ，目 的是 为了 鉴 别不同 性质 的细菌 ，所以又叫鉴别染色法。主要 的 复 染色法有 革 兰氏染色法和抗酸 性 染色法。（ 3） 革 兰 氏 染 色 法原理革 兰 氏 染 色 法 是 细 菌 学 中 广 泛 使 用 的 一 种 鉴 别 染 色 法 。1884 年由丹麦医师Gram创立。染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示； 染色反应呈红色的称为革兰氏阴性细菌，用G一表示。细 菌 对革 兰氏 染 色 的 不 同反 应 ，是由 于 它 们 细 胞壁 的成 分 和 结 构 不同而造成的。细菌的革兰氏染色步骤涂片干燥固定初染水洗媒染水洗脱色水洗 复染水洗干燥观察A） 取 培 养 物

3、分 别 做 涂 片 、 干 燥 、 固 定 ， 方 法 均 与 简 单 染 色 的 相 同；B） 用草酸铵结晶紫 染色 1mi n 后水 洗 ；C） 加碘液媒染1mi n后水 洗 ；D） 斜置载玻片，滴 加95 乙 醇脱 色 ， 至 流 出 的 乙 醇 不 现 紫 色 为止，大约需时2030 s ,随即水洗；E） 用蕃红染液复染30s，水 洗 ；F） 用吸水纸吸掉水滴 ， 待标 本 片 干 后 置 显 微 镜 下 ， 用 低 倍 镜 观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。二、影响革兰氏染色结果准确性的关键因素1. 试 剂 影 响 。这 是 我 们 首 先 应 该 确 保 的 ，我

4、们 使 用 的 试 剂 必 须 是 有效的。实验室应 当 建立有效的试剂管理程序，从试剂的验收到存 放 、使 用 、过 期 后 的 废 弃 处 理 都 应 有 严 格 规 定 ，确 保 我 们 使 用 的试剂是有效的。工欲善其事必先利其器，这也是我们试验成功最基础的一环。2. 染色菌的选择。菌龄对革兰氏染色结果的影响是十分大的。我们染色过程中选择 的 菌应该是处于活跃生长期，这样的细菌活性强，生理特 征明显，所以 染色的结果准 确度 高，一般 情况下不会出现误 差。培养时间较长 的革兰氏阳性 菌，由于细 胞 老化，甚至有部分菌在染色之前就已经死亡或者自行溶解了，造成细胞壁通透 性 增 加 ，就

5、 会 呈 现 出 假 阴 性 。以 金 黄 色 葡 萄 球 菌 为 例 ，金 葡 是 典型的革兰氏阳性菌，有人曾 经统计 过培养至不同 时间 的金葡的革兰氏 染色 结果，结果 表明，在金 葡 活跃期的22h- 26h 之间，染色结果 的准 确率基本可 以达到100 %，而超过26h 之 后 ，准确率就开始下降，培养至 36 h 时，准确率大概会下降30%左右。所 以我们在染色时，一定要 选 择处于活跃期、活性较强 的 菌落，在检测过程中一定要严格的 在 国标要求的时间段内进行 染 色试验，不能提前或者延后。3. 涂 菌 的 状 态 。在 染 色 最 初 的 涂 布 中 ，在 挑 取 菌 体 后

6、 应 该 在 无 菌 水 上 涂 成 薄 薄 的 菌 膜 。而 在 涂 布 过 程 中 ，若 是 菌 体 堆 积 ，也 会 极 大影响染色结果的准确性。菌落堆积过多，往往菌体之间变得毫无缝隙，而其细胞壁的成分影响造成了脱色的情况不佳，容易产生假阳性的结果。同时，在初染、媒染及复染的过程中，应将染 液覆盖整个菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌没有染色。因此在涂片过程一定要将菌膜涂得少而均匀，这样才能达到最佳效果。4. 媒染 时间 。媒染时 间对革兰氏 阴 性菌 的 染色结 果有 很大 影响 。由 于媒染时间过长，结晶紫在碘液长时 间 作用下过分牢固 结合在菌 体细 胞壁 上，影响 了酒精的脱色

7、效果 ，从而会 导致 这种假阳性的效果。以典型的革兰 氏 阴 性 菌 大 肠埃希氏菌为 例 ，有人做过统计，媒染时间严格控制 在 40 s - 60 s 之内，染色结 果 准 确率基本可达 到10 0%，而超过60s 准确率会有一定 的降低， 若媒染 超过100s，准 确率 甚 至可降低接 近20%左右。因此 在媒染过程中 一定要注 意媒染时间，控制在50-6 0s 为 宜 。5. 酒精 脱 色。酒精脱 色 也是一个对结 果 影响较大的操 作过程。革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌最主要的差异是细胞壁肽聚糖层厚 度和结构，革 兰氏阴 性 菌 细胞 壁 肽聚糖 层 很 薄，脂 多糖含量高因此在酒精脱色时，细菌细胞壁的多糖成分会被酒精溶解，增大了细胞壁的通透性，结晶紫及碘复合物就很快被酒精洗脱，之后就会被沙黄复染呈红色；而阳性菌肽聚糖层厚，脂多糖少，酒精只能起到脱水效 果而无 法 进 入，这 样结晶 紫 和 复合 物 就无法洗脱出来使细胞呈紫色。因此，酒精脱色时间短，脱色效果不佳，会导 致阴性菌菌体内的结 晶 紫 和 复 合 物 不能有效的全部洗脱出 来，就会出现明显的误差，使阴性菌出现假阳性。而洗脱时间过长，也会导致阳性菌的细胞壁被酒精破坏，导致细胞内的紫色被洗脱， 呈现假阴性。因此洗脱时间也是革兰氏染色的关键环节。洗脱时间应当严格控制