LeJA2基因沉默表达载体导入番茄转化系统的建立-5精选文档

1、LeJA2基因沉默表达载体导入番茄转化系统的建立目前,各类昆虫的侵害对农作物生产构成了极大威胁,而化学杀虫剂的使用对环境和人类健康都会产生极大的危害.因此明确植物自身的抗性 反响机制,从而降低化学药剂的使用量,成为目前的迫切需求和研究热点. 2022年,李传友等1发现作物系统抗性中可以进行长距离运输的是茉莉 酸而不是系统素,因此茉莉酸介导的抗性反响途径成为目前的研究热点.LeJA2基因是番茄抗性反响途径重要的上游调控基因,研究和明确该基因的功能对于研究茉莉酸抗性反响途径具有重要的意义.本研究利用根癌农 杆菌介导,将反义LeJA2基因导入番茄,并试图找到影响转化频率的主要 因素,建立起高效稳定的

2、番茄转化体系,为下一步进行更深入的研究打下 根底.1材料与方法1.1 材料和培养基1.1.1 菌株及基因 根癌农杆菌菌株 LBA4404; LeJA2-RNAi基因,长度 517 bp,位于载体 pUCCERNAt.1.1.2 植物材料 番茄常规品种M82,由中国科学院番茄资源研究中央 提供.1.1.3 培养基 种子生长培养基:1/2 MS;预共培养培养基：MS+1.0 mg/L ZT;筛选分化培养基：MS+2.0 mg/L ZT+500 mg/L Amp+100 mg/L Kana; 生根培养基：MS+50 mg/L Amp+50 mg/L Kana+1 mg/L IBA.上述培养基假设 加

3、抗生素,均需将无菌的培养基置于超净工作台上,待培养基冷却至60c 后,再将无菌的抗生素参加1.2 质粒检测方法采用碱解法提取质粒,于含EB (漠化乙噬)的1.2%琼脂糖上100 V电 泳45 min,紫外灯下观察,结果见图1.1.3 植物材料的准备取番茄常规品种M82,挑选饱满、粒大种子,用70%酒精消毒2 min,无菌水冲洗3遍；然后用10%NaClC»?6 1520 min, 再用无菌水冲洗3遍,接种于1/2 MS®本培养基上,于25c光照培养.7 8 d萌发后,在无菌条件下切成子叶块,预培养12 d后,即可用于转 化.1.4 根癌农杆菌菌株及培养农杆菌菌液的制备:挑取

4、一个单菌落接种于YEB液体培养基(附加50 mg/L Kana)中并于(27 ± 1) C、150 r/min 震 荡培养.菌液以5 000 r/min 离心10 min,弃上清,并用液体MS培养基重 新稀释悬浮后,以备转化之用.菌液浓度以肉眼鉴别浑浊,对着光不透明为好(OD260=0.6) 01.5 试验设计试验设侵染温度、侵染时间和菌液浓度3因素,因素及水平见表1,采用L9(34)正交设计.1.6 外植体的转化采用“叶盘法 24 o切取无菌苗的子叶获得 无菌苗块,在MS附加1.0 mg/L玉米素的D1培养基上预培养1 d,按正交表 所提供的处理进行侵染,即分别浸入制备好的农杆菌菌

5、液和液体MS中,以浸入MS中的子叶块作为阴性对照.侵染结束后取出,用无菌滤纸吸干,然后接种于无抗生素的共培养培养基上(培养基上放滤纸),在 (27 ± 1) 、有一定散射光的条件下共培养2 d后,取出转化块和对照块, 用100 mg/ L Amp液漂洗10 min,进一步除去农杆菌污染,以无菌滤纸吸干子叶块外表的液体,转入 MS+2.0 mg/L ZT+500 mg/L Amp+100 mg/L Kana的2Z培养基中进行抗性筛选(无滤纸).转入到抗性筛选培养基中的外植体,每23周继代一次.23周后,对照叶片全部变黄或褐化死亡,转化块 的许多外植体开始长出绿色或者白色的愈伤,也有局部

6、外植体变褐或死亡.培养58周后产生抗性芽.当不定芽伸长至23 cm时,用解剖刀将抗性芽切下,并转接至 MS +1 mg/L IBA+50 mg/L Kana+50 mg/L Amp 的生 根培养基上.1.7 PCR检测1.7.1 番茄总DNA提取 取45叶龄的转基因植株和对照植株的叶片按SDS法提取总DNA1.7.2 引物设计 根据目的基因两端序列,设计约20个碱基的2个引 物：LeJA2-RNAi- F(BamH ):5' -GGATCCAAGACGAATTGGATTA-3'LeJA2-RNAi- R(XbaI ):5' -TCGTCTAGATTAATACTTTCAA

7、CC-3'1.7.3 PCR 扩增95c变性5 min后,参加2 U/dlTaq酶1dl,然后94c 50 s, 55 C 90 s, 72 C 2 min,35 个循环；反响结束后,在含EB的1%琼脂糖凝胶上100 V电泳30 min,紫外灯下观察.2结果与分析2.1 转化频率的方差分析由表2可以看出,菌液浓度的R值最大,说明菌液浓度对抗性愈伤的出 愈率影响最大；其次为侵染温度和侵染时间.三者的最好组合为侵染浓度OD260=1.2,侵染温度40C,侵染时间10 min,此时转化率最高,为15.13%. 但实际试验过程中,中选取农杆菌的侵染浓度为 OD260=1.2时,竣苇霉素不 能很

8、好地抑制农杆菌的繁殖增生,外植体的边缘受到农杆菌的毒害而发黑从而死亡,这就大大降低了抗性愈伤的形成率和外植体的生长性,所以最终选择菌液浓度为 OD260=06因此,如果要建立高效的遗传转化体系,就 必须慎重选择菌液的侵染浓度,同时选择最适侵染时间和侵染温度,以期 获得大量的转基因植株.2.2 PCR检测结果选取30棵抗性苗进行PCR佥测,结果从14棵抗性苗中扩增出517 bp 的目的带,而未转化的番茄植株没有扩增出相应的条带图2.转化过程中出现了一些假阳性植株,可能是由于番茄遗传转化体系建立过程中,没有保证子叶外植体与培养基平整接触,导致其因快速生长而出现上翘和卷曲使农杆菌的接种面离开培养基,

9、从而使一些非转化细胞逃脱抗性筛选产生 假阳性植株.3讨论与结论3.1 从原理上说,菌液浓度越大,侵染外植体白机率越大,转化率越高 但当浓度过高,易造成污染,且很难除菌,影响外植体的分化.本试验结果 说明,虽然正交试验显示菌液浓度为OD260=1.2时,转化效率最高,但实际培养过程中,在此浓度时农杆菌大量繁殖,污染严重,许多外植体的边缘发 黑甚至死亡,所以最终选取菌液浓度为 OD260=0.&本试验结果还说明,子 叶外植体在菌液中浸泡的时间不能过长,一般10 min左右即可,以预防培养过程中出现子叶外植体褐化或农杆菌过度生长,抑制分化成苗.所以最第4页后选取的较优组合为菌液浓度 OD260=0.6,侵染时间10 min,侵染温度40 Co3.2 在转基因植株培养过程中,还会出现少数畸形化芽或玻璃化苗, 主要表现为畸形化芽的叶片大、厚,无生长点；玻璃化植株叶片、茎呈半透 明玻璃质,脆弱易碎,并且生根比拟困难.这对提升转化效率和转化的稳定 性都会造成一定影响 .3.3 本试验采用农杆菌介导法进行转化,经过严格地Kana抗性筛选, 淘汰了大量非转化植株,并