仪器分析――层析技术二、层析法实验技术

1、仪器分析层析技术二、层析法实验技术(一)凝胶层析法凝胶层析又称分子筛过滤、 排阻层析等。 它的突出优点是层析所用的凝胶属 于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围 下进行，不需要有机溶剂， 并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。 对于高 分子物质有很好的分离效果。1凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开， 由于它们在分配系数上有显著差异， 这种 分离又称组别分离，一般可选用 SephadexG-25和G-50,对于小肽和低分子量的 物质(1000-5000)的脱盐可使用 SephadexG-IQ G-15

2、 及 Bio-Gel-p-2 或 4.如 果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离， 这种分离又叫分级 分离。一般选用排阻限度略大于样品中分子量物质的凝胶， 层析过程中这些物质 都能不同程度地深入到凝胶内部，由于 Kd不同，最后得到分离。2柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于 1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D 般 宜在 7-10 之间，但对移动慢的物质宜在 30-40 之间。3凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于 5-10倍量的

3、蒸馏水或 洗脱液中充分溶胀， 溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。 自然溶胀费时较长， 加 热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸， 1-2 小时即可达到 凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧， 柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器， 柱内充满洗脱液， 将凝胶调成较稀薄 的浆头液盛于柱顶的容器中， 然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内， 这样凝胶 粒水平上升， 直到所需高度为止， 拆除柱顶装置， 用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶 床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在 平衡过程中逐渐增加到

4、层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜， 使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察 色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好， 色带出现歪曲、散乱、 变宽时必须重新装柱。4加样和洗脱凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和， 再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5-10。样品浓度与分配系数无关， 故样品浓度可以提高， 但分子量较大的物质， 溶液的粘度将随浓度增加而增大， 使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过 1.5-2. 样品加入后打开流出口， 使样品渗入凝胶床内， 当样品液面恰与凝胶床表面相平 时，再加

5、入数毫升洗脱液中洗管壁， 使其全部进入凝胶床后， 将层析床与洗脱液 贮瓶及收集器相连， 预先设计好流速， 然后分部收集洗脱液， 并对每一馏份做定 性、定量测定。5凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用， 不必特殊 处理，并不影响分离效果。 为了防止凝胶染菌， 可在一次层析后加入 0.02 的叠 氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用 70、 90、 95乙醇脱水平衡至乙醇浓度达 90以上， 滤干， 再用乙醚洗去乙 醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密 封后高压灭菌

6、保存。6凝胶层析的应用脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以 用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶 类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为 SephadexG-10、 15、 25或 Bio-Gel- p-2、 4、 6. 柱长与直径之比为 5-15，样品体积可达柱床体积的 25-30，为了 防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上， 一般用醋酸铵等挥发性盐 类缓冲液使层析柱平衡， 然后加入样品， 再用同样缓冲液洗脱， 收集的洗脱液用 冷冻干燥法除去挥发性盐类。用于分离提纯： 凝胶层析法已广泛用于酶、 蛋白质、氨基酸、多糖、激素

7、、 生物碱等物质的分离提纯。 凝胶对热原有较强的吸附力， 可用来去除无离子水中 的致热原制备注射用水。测定高分子物质的分子量： 用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱 内，在同一条件下层析， 记录每一分钟成分的洗脱体积， 并以洗脱体积对分子量 的对数作图， 在一定分子量范围内可得一直线， 即分子量的标准曲线。 测定未知 物质的分子量时， 可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后， 根据物质 的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。高分子溶液的浓缩：通常将 SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子 溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中， 而高分子 物质则排

8、阻在凝胶颗粒之外， 再经离心或过滤， 将溶胀的凝胶分离出去， 就得到 了浓缩的高分子溶液。（二）离子交换层析法离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相， 利用它与流动相中 的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。1离子交换剂预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不 易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度， 对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。 溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或0H的交换剂型。阴 离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-0H-型或盐型交换剂；对于阳离 子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。洗涤好的纤维

9、素使 用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气 泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层， 要适当加压装柱， 同时 使柱床压紧， 减少死体积， 有利于分辨率的提高。 柱子装好后再用起始缓冲液淋 洗，直至达到充分平衡方可使用。2加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离 子强度应低， 可用透析、 凝胶过滤或稀释法达此目的。 样品中的不溶物应在透析 后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不 要超过柱的负荷能力。 柱的负荷能力可用交换容量来推

10、算， 通常上样量为交换剂 交换总量的 1-5 。洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的 pH或改变离子强度的 方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全， 往往需要逐步改变 pH 或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将 不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子 强度的变化大， 使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱， 纯度较差， 不适宜精细的 分离。的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图 16-6. 两个容器放于同一水平 上,第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓 冲液，两容器连通，第一个容

11、器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容 器中的溶液就会自动来补充， 经搅拌与第一容器的溶液相混合， 这样流入柱中的 缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。 第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计 算：C= C2( C2- C1) (1 V) A2/A1式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1 C2分别表示容器中溶液的浓度； V为流出体积对总体积之比。当A1=A2时为线性梯度，当A1A2时为凹形梯度， A1 A2时为凸形梯度。洗脱时应满足以下要求：洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积， 从而使分离的各峰不致于太拥挤。 梯度的上限要足够高， 使紧密吸附的物质能 被洗脱下来。 梯度不要上升太快， 要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解 吸状态。 目的物的过早解吸， 会引起区带扩散； 而目的物的过晚解吸会使峰形过 宽。3洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定， 得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免 疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。4离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用2mol/: NaCI淋洗柱，若有强吸附物则可用 0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性 物质则可用非离子 型去污剂 洗柱后再 生，也可用 乙醇洗 涤，其顺序 为： 0.5moI/