蛋白相互作用Pull-Down实验

1、蛋白相互作用Pull-Down实验蛋白相互作用Pull-Down实验实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。Pull-Down实验可用来检测已知 的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。这个融合 标签就是用于Pull-Down实验的基础。最常见的标签为谷胱甘肽 S-转移酶（GST） 和多组氨酸（6XHis）。其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲Ni2+和 Co2+)。Phase 1In vitro Prey Protain Synlh

2、&sis(TMT« T7 System)零Og 挈 物Phase ?Immctailization of Eait (GST4usion)Proiein ocia MagneGST ParticlesEiperimentalCntrul(GST-Fusion)<GST)VXl03rtjH Binding Q/掌<©-gstJJ$1WashWa$hTTEluteElute1IIgstH+QGSTprey protain _ acted Figure L Overview of the MagjteGST Pull-Down Si P = Prev Prot

3、ein, M = MagneGST Particle.挈 &sA I i?stem protocoL7实验准备工实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶(银离子琼脂糖凝胶)、离心机、实验材料：表达的含标签的纯化蛋白，细胞裂解液实验试剂工 Rinding Buner/Washing Buffer: 4JmM N即HPO4、2mMKH?PO4、UOmM NaCL 10mM KClSDS loading Buffer: 50rnM TriC(pH6.8). 2%SDS、0.1%浪酚蓝、10%甘 油、10mM DTT裂解缓 冲液：20mM Tris-CKpHS.tt)、200mM NaCl、 ImM ED

4、TA(pH8.0)、0.5% Nonidet IMO使用前加入加入蛋白酶抑制剂，蛋 白酶科制剂：2ug/ul 抑肽酶(aprotinin)> lug/ul 白胃 素(leupeptin)、OJug/ml 胃酶抑素(pepstatin)、 25ug/ml苯甲磺酰氟(PMSF) 实验方法;方法一：1、预清除细胞裂解液：将细胞裂解液与50ul的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ug GST在4七混 合孵育2鼠离心机12,000g在41c离心2mm将上清转移至新的离心管中*人探测细胞裂解液两个含等量预清除细胞裂解液及50ul谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。在 一管中加约lOug的C5T蛋白，另一

5、管中加约10i里的GST融合探针蛋白。 两个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应该是等摩尔的.将离心管在4t 翻转混合孵育2k最大速度在4c离心样品2min.在新的微量离心管中收集上清.用1ml冰冷的裂解液洗球珠,在离心机上以最大速度离心1mL弃去上清.重复洗三次。加入50ul 20mmol/L的还原型谷胱甘肽到球珠中，洗脱GST融合蛋白及任何与其结合的蛋白质。在离心机上最大速度离心2min。将洗脱蛋白质与等体积的2X SDS-PAGE上样buffer混合。3、检测相互作用蛋白质将样品煮沸4min,进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。方法二：1、5ug目的GST融合探针蛋白和GST蛋白分别和谷胱甘

6、肽琼脂糖凝胶球珠 在4c孵育结合30min。2、结合GST融合探针蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠与100ul细胞裂解液结合在4 c作用4h03、3000rpm在4 c离心5min ,除去上清。4、用洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠，3000rpm在4c离心5min ,除去上清，重复5次。5、取谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠进行 SDS-PAGE电泳分析。方法三：实验试剂：PBS (140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mMKH 2PO4)Elution Buffer: 50mM Tris-Cl(pH8.0) 、10mM 还原型谷胱甘肽0.154g 溶解到 50ml

7、 50mM Tris-Cl(pH8.0)中配制 Hution Buffer。1、细胞裂解取1ml细菌培养液离心去上清，加200ul细胞裂解液到菌丸，在室温下重悬并轻柔的混匀。将其在室温下晃动孵育20-30min。2、固定GST融合蛋白到柱子上将谷胱甘肽琼脂糖凝胶颠倒混匀后取 20ul至M.5ml离心管中，小心去除上清，加250ul Binding Buffer或wash Buffer到凝胶中，混匀。重复洗 3次以上。平衡好的凝胶用100ul Binding Buffer或wash Buffer重悬。力口 200ul含 GST融合蛋白的细菌裂解液，在旋转的台子上室温下孵育 30min。小心移去上

8、清，(保存以便分析，)将250ul Binding Buffer或wash Buffer 加到凝胶中，轻柔混匀，在室温下孵育5min。小心移去上清。加入 250ulBinding Buffer 或 Washing Buffer 再次清洗，将凝胶用 20ul Binding Buffer 或 wash Buffer 重悬。1、捕获猎物蛋白将5ul固定GST融合蛋白的凝胶中加入 20ul含猎物蛋白的溶液，将 155ul Binding Buffer 或 wash Buffer 和 20ul 10%BSA 加入凝胶中，在室 温下旋转孵育1h。移去上清。将400ul Binding Buffer或wa

9、sh Buffer加入凝胶中，轻柔混匀，在室 温下孵育5min ,移去上清。力口 400ul Binding Buffer或wash Buffer再次 清洗凝胶。小心移去上清。分析：力口 20ul SDS-PAGE loading Buffer ,在室温下混合 5min。取出上清用 于分析。His Pull-Down 方法实验试剂：Binding Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0) 、150mM NaCl、20mM 咪唾 Elution Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0) 、300mM NaCl、500mM 咪唾 实验步骤：1、结合蛋白裂解后，经0.45

10、um滤膜过滤，2、与Ni-NTA树脂(1ml蛋白裂解液上清结合5ul树脂)4c混合孵育3h。3、待树脂沉淀后用10倍柱体积的锲柱洗涤缓冲液洗去杂蛋白。4、用6倍柱体积锲柱洗脱目的蛋白。5、纯化后的蛋白用PBS和超纯水透析，冻干。6、SDS-PAGE电泳分析7、纯化的蛋白与Ni-NTA树脂冰浴作用2h,8、10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤，9、然后加入过量100ug/ml蛋白溶液，冰浴作用2h ,10、用10倍柱体积的锲柱洗涤缓冲液清洗，11、加入1倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，12、洗脱蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。13、阴性对照为结合蛋白溶液加入 Ni-NTA树脂中冰浴作用2h。10倍柱体积的锲柱洗涤缓冲液清洗，加入1倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，注意事项：1、所有过柱的液体都要经过 0.45um或0.22um的滤膜。2、平衡柱子：2.1 用3-5个柱体积蒸储水洗柱2.2 用3-5个柱体积的binding buffer平衡柱子。3、洗柱：如谷胱甘肽琼脂糖凝胶的柱子失去结合能力，需要洗去柱子上的杂质3.1 除去变性物质，用2个柱体积的的6M盐酸月瓜洗柱子，然后用5个