长期大强度运动大鼠脑组织阿黑皮素原mRNA表达的变化

1、长期大强度运动大鼠脑组织阿黑皮素原mRNA表达的变化*摘要目的和方法：采用生物素标记阿黑皮素原(POMC) cRNA探针(Bio-cRNA)原位杂交法结合象分析，从基因转录水平观察长时期(共7周)大强度(速度由15 m/min递增至35 m/min，运动时间为2025 min/d)跑台运动的大鼠不同脑区POMC mRNA表达。结果：该强度下大鼠末次运动结束后POMC基因表达在额叶皮层、海马CA1下降(前者至运动结束后3 h仍未恢复，后者至运动结束后30 min即恢复)，在下丘脑则增强。结论：POMC mRNA表达在该强度下运动的大鼠不同脑区呈现不同的动态变化趋势。主题词前阿片黑素细胞皮质激素；

2、RNA，信使；杂交 Effects of long term and high intensity exercise on pro-opiomelanocortingene expression in rat brainCHEN Jia-Xu,YANG Wei-Yi,LIANG Rong,HUANG Qi-Fu,LIU Xiao-Lan,DONG HaoBejing University of Chinese Medicine,Beijing (100029)Abstract AIM and METHODS:In situ hybridization using biotin-labeled

3、pro-opiomelanocortin (POMC) cRNA probe,and integrating image pattern analysis were used to observe the effect of long term (total 7 weeks) and high intensity treadmill exercise (speed from 15 m/min gradually increased to 35 m/min with 0 degree,20 to 25 min/d duration) on the changes of POMC mRNA exp

4、ression in different areas of rat brain.RESULTS：Post-exercise instantly,the expression of POMC mRNA was decreased in frontal cortex,in which it was not recovery yet at post-exercise 3 hours;also decreased in hippocampal CA1,in which it was recovery at post-exercise 30 minutes.But the expression of P

5、OMC mRNA was increased in hypothalama.CONCLUSION：The dynamic changes of POMC gene expression in different areas of rat brain responding to such long term and high intensity exercise were not the same.MeSHPro-opiomelanocortin;RNA,messenger;Hybridization 运动为一种应激源，而应激与阿黑皮素原(pro-opiomelanocortin,POMC)系统

6、有关1。我们已报道长期(共7周)大强度跑台运动(速度由15 m/min递增至35 m/min，运动时间为2025 min/d)下对大鼠血乳酸、血-内啡肽及强啡肽A1-13、亮氨酸脑啡肽的影响2。本研究运用生物素标记POMC cRNA探针进行原位杂交并结合象分析，观察该强度运动下大鼠脑组织POMC信使RNA(messenger RNA,mRNA)表达的变化。材料与方法动物：二级Spargue-Dawley雄性大鼠，体重180220 g。由北京医科大学、解放军301医院等实验动物中心提供。适应训练：实验动物(200只)置于室温(202)、湿度40%动物室中，每5只1笼，自由进食饮水；适应实验环境1

7、2 d后开始训练，采用递增强度的方式在国产电动鼠类跑台(购自杭州)上运动，坡度为0。从训练第一周起，每周递增速度，每周速度分别为15 m/min、22 m/min、27 m/min、31 m/min、35 m/min。每天训练20 min，每周5 d，共训练5周。第5周后按以下方案进行训练。一般训练：于第6、7周每只动物每日按35 m/min的速度，在坡度为0的跑台上跑20 min。强化训练：于第6、7周每只动物每日按35 m/min的速度，在坡度为0的跑台上跑25 min。造模周期共计7周，于第8周始取材，末次运动速度仍为35 m/min，时间为30 min。安静对照组(A组，n=13)：自

8、实验开始第17周直到第8周取材日不进行任何运动训练。训练对照组(B组，n=12):接受5周的适应训练后，进一步进行2周的一般训练，于第8周取材日安静状态下取材。强化训练组(C组，n=56)：接受5周的适应训练后，再接受2周的强化训练。于第8周取材日将动物随机分为运动前安静态(C)、运动后即刻(E)、运动结束后30 min(F)与3 h(G)。大鼠经10%水合氯醛(400 mg/kg体重)麻醉后，剖开胸腔，经左心室向升主动脉插管，先以预冷的0.9%生理盐水速灌冲洗，一般约需100200 mL，直至流出液体变清为止；继之灌入预冷的4%多聚甲醛溶液(0.1 mol/L PB配制，pH7.4) 300

9、 mL，约30 min；取脑置于4%多聚甲醛溶液中4后固定610 h。然后将脑组织移至20%蔗糖溶液(0.1 mol/L PB配制，pH7.4)中于4保存，待组织下沉后，液氮骤冷，于-20 在LEICA-CM 1900型恒冷箱切片机中制备10 m切片，裱贴在预先经2%APES(3-aminopropyltriethoxysilane,购自北京中山生物技术有限公司)胶处理的载玻片上，空气中干燥后置-70冰箱中备用。质粒的转化、扩增与提取：含POMC cDNA片段的质粒(克隆载体为PGEM-4Z，含442 bp的POMC cDNA片段)由澳大利亚Dr.DOMINIC AUTELTANO赠送。按碱裂

10、解法对该质粒进行大量制备。生物素标记试POMC cRNA探针的制备：随机引物标记试剂盒(Promega产品)，PCR生物素标记试剂盒、Taq酶等购自华美生物工程公司。在Eppendorf管中按顺序加入50 ng DNA模板(POMC),3 L随机引物(Random Primer),3 L 2 mmol/L NTP (2mmol/L ATP、CTP、GTP， 1mmol/L TTP、1mmol/L Biotin-UTP)，8 L 10PCR缓冲液，30.5 L无菌水，0.5 L Taq酶。然后加封石蜡油，置于PCR仪，变性、退火、延伸的参考温度分别为94、35 、72 ，时间均为40 s，共35

11、个循环。POMC原位杂交程序：冰冻切片经室温平衡，水化后继之按以下步骤进行。0.3%甲醇-H2O2封闭，避光，37，30 min； 0.1 mol/L HCl， 室温，10 min;100 g/mL蛋白酶K， 37消化20 min； 4%多聚甲醛固定，室温，5 min；以上各步之间用PBS(pH 7.4)充分漂洗；70%冷乙醇、100%冷乙醇各5 min；滴加杂交液，22 L/片，杂交液组成为：10 L 50%甲酰胺，4 L 20SSC， 2 L 20Denhards液，1 L ssDNA，1 L 1 M DTT,2 L 50% Dextra sulfate,2 L POMC Biotin-c

12、RNA探针，经过6090变性35 min；置于湿盒中(含50%甲酰胺)，42孵育，24 h；2SSC,15 min 2次；1SSC,15 min 2次；ABC复合物(试剂盒为Vector公司产品，稀释度为1100)，37，1 h； PBS 3 min 3次；0.05% DAB 加0.01% H2O2，镜下控制显色时间，酒精梯度脱水、二甲苯透明、树胶封片。阴性对照组：用不含POMC生物素化的cRNA探针杂交液进行杂交，其它步骤同上；阴性对照实验中未发现阳性细胞出现，即无特异性反应。采用Cambridge QTM 970型象分析系统，对杂交阳性细胞进行定量检测。放大倍数为40220(物镜放大倍物透

13、射放大倍数电路放大倍数)，每组随机测试6张切片，每一部位随机测试1个视野；分别测量POMC阳性细胞个数(number)、数密度(numberical area,100/mm2)、阳性物面积(area,m2)、平均光密度(mean optical density,MOD)、积分光密度(integrated optical density,IOD)和阳性物面密度(area density)。用光密度表示各蛋白的相对含量，因IOD结合了阳性物面积和MOD两方面因素，故主要选取IOD表示mRNA水平的相对含量。实验结果均以平均值标准差(s)表示，两两比较采用Studentt检验；组间差异采用方差分析(

14、analysis of variance,ANOVA)，继之以Duncans检验；以P0.05作为差异显著性的标准。结果光镜下可见，POMC杂交阳性信号位于胞浆内，胞核不着色，呈棕黄色颗粒，阳性细胞广泛分布于皮质、海马、丘脑、下丘脑等脑区及其核团。对额叶皮质、海马CA1区和下丘脑阳性细胞进行象分析，结果分别见表1。表1各组大鼠不同脑区POMC mRNA表达象分析结果Tab 1 Quantitative results of POMC mRNA gene expression of rat brain in each group (IOD,s)GroupFrontal cortexHippoca

15、mpal CA1HypothalamaA:Normal control1649.8379.55604.41986.81521.4585.5B:Exercise control1125.2211.04700.9810.51974.7296.2C:Pre-exercise3805.2828.96763.82973.71629.3470.4E:post-exercise instantly1608.2233.62685.0614.82376.3973.2F:Post-exercise 30 min1680.6583.75582.2905.42516.6787.4G:Post-exercise 3h1

16、689.0402.26616.61569.42255.4728.3P0.05,P0.01,vs A group;P0.01,vs B group;P0.05,P0.01,vs C group;P0.01,vs E group 1.POMC阳性信号在额叶皮层的IOD变化情况：在安静状态下A、B组IOD均分别显著低于C组(P0.01)，B组IOD较A组显著下降(P0.05)。强化训练运动后即刻E、30 min F及3 h G之间IOD无明显差异(P0.05)，但均较运动前安静态C呈极显著下降(P0.01)。2.POMC阳性信号在海马CA1区IOD变化的情况：在安静状态下各组IOD差异不显著。强化训

17、练运动后即刻E其IOD显著低于C组(P0.01)，在恢复过程中30 min F、3 h G其IOD分别较即刻E极显著增高(P0.01)而至正常水平。3.POMC阳性信号在下丘脑IOD变化的情况：在安静状态下B组IOD显著高于A组(P0.05)，强化训练运动后即刻E、30 min F、3 h G其IOD均分别显著高于C组(P0.05或P0.01)，但E、F、G间IOD无显著差异(P0.05)。讨论POMC是促肾上腺皮质激素、-内啡肽、-促黑激素等的前体，主要在垂体合成，除垂体之外，有关POMC基因表达部位还有下丘脑、杏仁核、大脑皮层3等。POMC纤维少量分布于下丘脑弓状核，但腹侧正中至前连合区域

18、有大量的POMC神经分布4，应激与POMC系统有关1；有资料显示急性应激除影响-内啡肽释放外，也增加POMC合成和加工的速度5，6；反复足电震一周后POMC mRNA水平仅在垂体前叶增加，而在垂体中叶无变化7。本实验用原位杂交方法，显示POMC阳性细胞广泛分布于大鼠脑皮层、海马、丘脑、下丘脑等脑区及其核团。对于慢性运动应激，POMC积分光密度于额叶皮层在安静状态C显著升高，在海马CA1区与下丘脑则变化不明显；表明长期运动应激仅使额叶皮层POMC表达增强。而在此基础上强化训练运动结束后即刻POMC含量在额叶皮层、海马CA1区较运动前均显著下降，可能是大强度运动使该区POMC基因表达下调，在额叶皮

19、层POMC于运动结束后30 min、3 h仍未恢复，在海马CA1区于运动结束后30 min即得以恢复；而在下丘脑POMC含量于强化训练运动结束后较运动前持续升高，可能是大强度运动使下丘脑区POMC基因表达增强。此结果表明：长期(共7周)大强度的跑台运动(速度由15 m/min递增至35 m/min，运动时间为20至25 min/d)的大鼠，末次运动结束后POMC基因表达在额叶皮层、海马CA1下降(前者至运动结束后3 h仍未恢复，后者至运动结束后30 min即恢复)，在下丘脑则其表达增强；表明该强度下应激的大鼠POMC基因表达在不同脑区呈现“双向”变化。*国家自然科学基金重点项目(No.3943

20、0140)作者单位：北京中医药大学基础医学院 (北京 100029)参考文献1Przewlocki R.Opioid systems and stress.In:Albert Herz.ed.Opioids .Springer-Verlag,1993.294297.2陈家旭，杨维益，梁嵘，等.长时期大强度运动对大鼠血乳酸、-内啡肽、强啡肽A1-13、亮氨酸脑啡肽影响的实验研究.中国应用生理学杂志，1997，14：371.3Civelli O,Birnberg N,Herbert E,et al.Detection and quantitation of proopiomelanocortin mRNA in pituitary and brain