肿瘤细胞培养(完整版)

1、第 6 章 肿瘤细胞的培养肿瘤细胞培养是研究癌变机理、 抗癌药的敏感性、 肿瘤细胞和癌分子生物学特性的重要 手段。 癌细胞是比较容易培养的细胞， 当前所建立的细胞系中癌细胞是最多的。 应用体外细 胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：(1) 可免受机体内环境因素的影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化和生物 因素对肿瘤细胞生命活动的影响。(2) 既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究 癌变的发生机理；(3) 可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。(4) 可用于快速筛选抗癌药物和研究耐药机理。(5) 研究周期短，比较经济。但是它也有缺

2、点， 如长期培养可使细胞生物学特性发生改变； 体外实验所得的结果不能 完全代表体内的情况，应与体内试验结合研究更为合理等。一、肿瘤细胞培养的生物学特性1、形态和性状 形态不规则，细胞界限清晰，伸展较差，核膜、核仁轮廓明显，核仁多、核浆丰富。折 光性强，电镜观察细胞表面微绒毛多而细密， 与肿瘤细胞具不定向运动和铺着不依赖性有关。2、生物特性癌细胞在无血清或低血清 (2% 5%)时仍能生长，营养要求不高，因能自分泌促增殖因 子，在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失， 再加上失去了接触抑制， 癌细 胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱和密度大，有丰富的三极有丝分裂，分裂指数高， 细胞倍增

3、周期短。3、永生性永生性也称不死性，在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡 (Apoptosis) ，体外培养的肿瘤细胞系 (株 )都表现有这种特性。但体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性(包括侵润性 )是两种性状， 受不同基因调控的， 因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功， 生 长增殖能力并不旺盛，有时只能传若干代，说明体外培养的永生性可在体外培养后获得的。 另外，体外培养的许多细胞系，如 NIH3T3 、 Rat-1 10T1/2 等均具有永生性而无恶性。但两 者有相关性，永生性可能是细胞恶性变的某一阶段。4、侵润性 侵润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为， 体外培养的肿瘤细胞仍保持有这种特

4、性， 当与正常 组织混合培养时，能侵润入其他正常组织中，甚至能穿透人工隔膜。5、异质性 所有肿瘤细胞都是由增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成，属于 异质性，其中有的衰老、 退化， 有的处于周期阻滞状态， 只有那些处于活跃增殖的肿瘤干细 胞才是支持肿瘤生长的成分， 肿瘤干细胞易于生长增殖， 分离培养干细胞的方法称干细胞培 养( 有干细胞系和数个亚系组成 )。6、细胞遗传性失去二倍体核型， 呈异倍体或多倍体， 常有标记染色体出现，正常细胞与恶性肿瘤细胞 的区别，如表 6-1 所示。表 6-1 区别正常成纤维细胞与恶性肿瘤细胞的常用指标指标正常成纤维细胞恶性肿瘤细胞形态棱形或多角形

5、，伸展良好， 折光较弱，核浆比例小，嗜 碱性弱，核仁较少较小，多 核巨细胞少见多角形或细长形，伸展较 差，折光强，核浆比例大， 嗜碱性强，核仁多、大，常 见多核巨细胞生长特性排列有方向性，单层生长，有接触抑制，饱和密度低方向性消失，多层重叠生 长，接触抑制消失，饱和密 度高粘附性细胞间粘附性强， 紧贴壁生 长细胞间粘附性弱，易脱落血清的要求必须有血清无需血清能生长在半固体琼脂中生长能力不能生长能生长，形成集落电子显微镜观察核蛋白体较少， 微丝微管有 规则排列核蛋白体丰富， 微丝微管消 失细胞膜对低分子物质通透性 粘多糖的合成和分泌腺苷酸 环化酶活性 细胞内 CAMP浓度低 多 高 高高 少 低

6、 低对松孢菌素的反应不刺激核分裂， 或至多形成 双核细胞核持续分裂， 形成多核巨细 胞致瘤试验不能形成肿瘤能形成肿瘤二、培养肿瘤细胞的生物学特性的检测 体外培养的细胞一旦建立细胞系就需要进行一系列的细胞生物学特性鉴定，其目的在 于：证明培养的细胞是否来自原来的肿瘤细胞。 说明肿瘤组织类型。 描述肿瘤细胞的生物学 特性。通常要检查下列项目：1、组织起源应说明培养材料起源于哪个胚层、器官组织、 什么样供体、何种疾病等，必要时要提供 病理诊断鉴定资料。2、形态观察观察细胞一般形态如细胞形状， 核浆比例倒置， 有丰富的三极或多极有丝分裂， 核仁清 晰、多个，微丝、微管排列紊乱。3、细胞生长特点检测细胞

7、生长曲线， 细胞分裂指数， 倍增时间及细胞周期。 癌细胞失去正常的接触抑制， 呈多层生长，生长旺盛，倍增时间缩短，饱和密度大，分裂指数较高，具无限增殖能力，细 胞浸润能力较强等。4、软琼脂培养 癌细胞在低密度下仍具有高度存活率，并在软琼脂中形成集落。5、细胞核型分析 检测核型特点，染色体数量，有无标记染色体，染色体带型等，癌细胞大多为异倍体， 多倍体，并有标记染色体。6、动物致瘤试验 裸鼠背部皮下接种 1× 10 9 2× 109/L 癌细胞能生长形成实体瘤， 其组 织学形态与原发瘤相似。7、组织化学检查癌细胞中脱氧核糖核酸、 酸性磷酸酶和磷脂增多， 碱性磷酸酶下降， 乳酸

8、脱氢酶和琥珀 酸脱氢酶活性也改变。8、其他生物学特性检测有凝集试验等。三、肿瘤细胞的取材和培养（一）肿瘤细胞的取材方法 培养肿瘤细胞的材料一般来自患者，对实体瘤患者可取原发肿瘤组织或转移灶，有胸、 腹水患者可取胸水或腹水，白血病患者可取血液或骨髓液进行培养。1、实体瘤取材方法取术后或活检标本， 要尽早浸入无血清培养液保鲜， 尽快进行培养。 尽可能去除溃疡及 坏死组织，避免细菌、霉菌污染，对取自外露的肿瘤组织，应在培养前在含二性霉素B 2 g/mL ，青霉素 200 1000u/mL ，链霉素 500g/mL 的培养液中浸泡 1020 分钟，再用洗液 反复冲洗干净后，再作培养。2、体腔液的取材方

9、法 在无菌条件下采取体腔液 （ 胸水或腹水 ） ，不需加抗凝剂， 可直接以 1200r/min 收集细胞， 不要久置，也不要在冰中冷却，而应尽早接种。3、血液 （骨髓 ）取材法白血病患者可取血液或骨髓， 主要以取外周血为研究对象， 用肝素抗凝的注射器无菌抽 取 5 10mL 外周血，置于试管中立刻分离培养。（二）肿瘤细胞的培养方法 肿瘤细胞对培养基要求不如正常细胞严格，一般常用RPM1640 ，DMEM 、 Mc-Coy-5A等培养基， 血清浓度不高， 10%即可，建议在原代培养时最好能加入生长因子或原患者血清 （1% 2%）以利细胞生长，培养方法很多，主要有组织块法、酶消化法、钽网法、脱落细

10、胞 法等。原代细胞的培养方法如下：1、组织块培养法将取得的瘤组织去除脂肪 结缔组织及坏死部分，在平皿中用 Hanks 液洗 3 次，剪碎组 织，切成 12mm 3小块，接种于事先涂有鼠尾胶原的培养瓶（或皿）中，37 5%或加盖瓶塞在普通恒温箱中培养。2、酶消化法在上述的碎组织块中加入 0.25% 胰蛋白酶或 （2000u/ml 胶原酶 ）在 37水浴中消化 30 分钟（或更长一些 ） ，去除消化液，用洗液洗 3次，培养液洗 1 次后，用完全培养基悬浮，并用 吸管吹打分散制成细胞悬液，计数。以5× 108 10× 108/L 细胞浓度，在含有 10%小牛血清的 RPMI164

11、0（或 Eagle MEM或 DMEM中） 37 5% CO2下分瓶 （ 或皿） 培养。3、钽网培养法在一张面积约为 1cm2的钽网上放入上述剪碎的一块或几块肿瘤组织块（12mm3大小） ，用镊子轻压，使其粘于网上，再把钽网放入培养皿中，使网下的组织块与皿壁紧紧接触，于 37 5% CO2下培养，每隔 23 天换液一次， 5 天后可见有上皮细胞从网上移出，并能在相 当于肿瘤组织部位形成纯净的单层上皮细胞。3、脱落细胞法将新鲜的肿瘤组织去除脂肪和结缔组织， 洗液洗 2 次后，用刀片将肿瘤组织切成细薄片， 在切割的同时有许多上皮细胞脱落下来， 脱落细胞经洗涤后， 加入完全培养基， 便可获得较 纯的

12、上层细胞，于培养瓶 （或皿）中、37 5% CO2下培养，每隔 23天换液， 7 10天上皮 细胞逐渐长成单层。在原代培养中，常在培养物中混有正常成纤维细胞，若把正常细胞误认为是癌细胞， 就 会使整个工作失去意义， 若不及时去除这些成纤维细胞， 由于它比肿瘤细胞生长快， 最终能 抑制肿瘤细胞的生长。因此，尽早排除成纤维细胞，已成为肿瘤细胞长期培养建系的关键， 现已发现有许多因素能抑制成纤维细胞生长 （见表6-2） 。表 6-2 抑制成纤维细胞生长的因素方法因素组织细胞选择性附着胰蛋白酶胚胎小肠、心肌表皮胶原酶乳癌选择性附着底物聚丙稀酰胺各种肿瘤聚四氟乙烯 （Teflon）转化细胞胶原（猪皮）表

13、皮细胞汇合饲细胞层小鼠 3T3表皮人胎小肠正常和恶性乳腺上皮结肠癌选择性培养基D- 缬氨酶 (Valine)肾组织MCDB-710乳腺MCDB-153表皮Phenobarbitone肝细胞（三）成纤维细胞的排除方法为了在肿瘤细胞中排除成纤维细胞，常采用五种方法，即机械刮除法、反复贴壁法、消 化排除法、胶原酶消化法、密度梯度离心法。1、机械刮除法 用不锈钢丝末端的橡胶刮头 （用胶塞剪成三角形插入不锈钢丝 ）或裹上少许脱脂棉制成， 装入试管中高压蒸气灭菌后备用 （也可用特制电热烧灼器刮除 ）。程序如下：（1）标记 镜下观察，用记号笔在培养瓶 （皿 ）的背面圈下肿瘤细胞的部位。（2）刮除 弃掉培养液

14、，把无菌胶刮伸入瓶 （皿 ）中，在肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记 细胞空间。（3）Hanks 液冲洗 12 次，洗除被刮掉的细胞。(4) 加入培养基继续培养，如仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至彻底刮净为止。2、反复贴壁法根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点， 并结合使用不加血清的营养液， 把含有 两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离。方法如下(同贴壁传代 )：(1) 待细胞生长达一定数量后，倒去旧液，用0.25%胰蛋白酶消化后， Hanks 液洗 2 次，加入不含血清的培养液吹打分散，制成单细胞悬液。(2) 取三个培养瓶分别编号为 A 、B、C，首先把细胞悬液接种入 A 瓶，置温

15、箱中静置培 养 5 20 分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后，慢慢吸出全部培养物，再接种于B瓶中，然后向 A 瓶中补充完全培养基置温箱继续培养。(3) B 瓶中的细胞静置培养 5 20 分钟后，按处理 A 瓶的方法，把 B 瓶中的培养液和细 胞悬液吸出并注入 C 瓶中，再向 B 瓶补加完全培养基， C 瓶补加少量小牛血清 ( 浓度为 10%)。三个瓶一并在培养箱中培养，如操作成功，次日观察，可见 A 瓶中主要为成纤维细胞， B 瓶中两类细胞混杂， C 瓶中主要为上皮细胞 ( 癌细胞 ) ，必要时可反复处理几次直至癌细胞 纯化为止。3、消化排除法此法曾用于乳癌细胞的培养，具体方法如下：(1

16、) 先是用 0.25%胰蛋白酶和 0.02%EDTA(1:1) 混合液漂洗培养细胞一次，然后加入新的 混合液继续消化直到有半数细胞开始脱落时，立即停止消化。(2) 把消化液离心弃去上清，沉下的细胞用培养基重悬并吸入另一培养瓶中，置温箱培 养，向原瓶中补加新的培养基继续培养，此法处理后，鉴于成纤维细胞比肿瘤细胞先脱落， 原瓶中留下的多为肿瘤细胞，经过几次反复处理，就能把成纤维细胞除净。4、胶原酶消化法 本法是利用成纤维细胞对胶原较为敏感的特点，通过消化进行选择。(1) 可用 0.5mg/mL 的胶原酶消化处理，边消化边在镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉 后即终止消化。(2) 用 Hanks 液洗

17、涤处理一次后，更换新培养基，继续培养，可获纯净肿瘤细胞，若未 清除净，可再次重复。5、密度梯度离心法用泛影葡胺和聚蔗糖配制成比重1.025 1.085 的密度梯度分离液，加入细胞悬液后，2500r/min 离心 10分钟，在比重 1.025 1.050 层为成纤维细胞， 在比重为 1.065 1.085层为 上皮细胞，将收集的上皮细胞经洗液3 次后，进行培养可获纯净的肿瘤细胞。最近，有人用 SOD 来抑制成纤维细胞的生长，这些方法都需进行预试验取得经验，找 出适合条件，才能获得好结果。(四) 血癌细胞分离培养1、采血与分离白细胞用肝素抗凝的注射器无菌抽取白血病患者外周血5 10mL，置无菌离心

18、管中，斜放于37的水浴中，待红细胞沉淀后，将血浆部分吸入另一离心管中，以1500r/min 离心 15 分钟，收集细胞， 用含 20%小牛血清的 RPMI1640含 50u( g)/mL 青、链霉素 培养液调整细胞浓度至 1×109 细胞 /L 以上，开始接种浓度要大。培养基中加入患者血清为1%2%。2、原代培养物的维持：将分离的患者白细胞种入链霉素小瓶中，每瓶3mL在 37温箱中进行悬浮状态的静置培养，每隔 2 3天半量换一次，吸出 1.5mL 旧液弃去，加入新鲜完 全培养基 1.5mL 。若换液前培养基中的 pH 有下降，说明细胞存活，起先一直坚持换液，不 分瓶传代，直至细胞有明

19、显增殖再扩大培养。3、传代培养（直到建系）细胞增殖后， pH 下降明显时，说明细胞有明显增殖，此时摇动细胞，在细胞悬液中有 少量细胞结成的团块，可转入传代培养，开始以 1:2 分瓶培养，当传至 10 代左右，细胞开 始生长减慢，几乎不分裂，甚至有许多细胞死亡，此时再并瓶培养，坚持每 3 天换液一次， 2 3 周后细胞已适应了外界环境，开始增殖，然后每2 天换一次液，每周传一代，即加入等量培养基以 1:2 分瓶培养，细胞增殖快时以 1:3 分瓶，即每瓶加入 6mL，共计 9mL，分成 3 瓶，每瓶 3mL，继续培养，当传至 20 代以上时已基本稳定，可以认为已基本建系，我院共 建了两个白血病细胞

20、系，即 S7811粒单型白血细胞系和 S801 急性淋巴细胞白血病细胞系。（五）提高肿瘤细胞培养存活率和生长率的措施根据人们的经验， 肿瘤细胞在体外不易培养，建立能够传代的细胞系更为困难， 当肿瘤 组织或细胞初代培养后，常出现以下几种情况：（1）完全无细胞游离出或移动。（2）有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传代。（3）传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才呈现旺盛生长状态，形成稳定生 长的肿瘤传代细胞系。以上说明： 肿瘤细胞原代培养时对体外生存条件有较高要求， 并需经对新环境适应才能 生长，因此不能局限于一般培养法，必须采取特殊的措施。1、适宜底物把纯化的细胞

21、接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层或饲养细胞层等。2、生长因子 将促进细胞生长因子加入培养基中进行细胞培养， 常用胰岛素、 氢化可的松、雌激素以 及其他生长因子。3、动物体媒介培养为了提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应和增加有活力的癌细胞 （ 干细胞 ） 的数量，可采 用动物体转嫁接种成瘤后， 再从动物体内取出进行培养， 能提高体外培养的成功率， 受体动 物以裸鼠最好。方法如下：（1）瘤块接种 取新鲜瘤组织，用 Hanks 液洗净血污，切成 13mm3 小块，用穿刺针头吸 一小瘤块，于皮下注入瘤块。（2）待肿瘤生长达较大体积后剥取出瘤组织。（3）进行体外培养。（4）为防止失败，可取部分瘤细胞在裸

22、鼠体内传代，通过裸鼠媒介接种，使肿瘤干细胞 数量增多，细胞易于培养成功。（六）肿瘤细胞体外培养应注意的事项1、在原代培养时应注意的问题(1) 培养材料应取自肿瘤细胞集中、活力较好的部分，取材后应立即培养并存放于培养 液中。(2) 取材和培养过程中要防止细菌和霉菌污染。(3) 培养物中混有的成纤维细胞要尽快清除。(4) 癌组织中若有淋巴细胞浸润，应采用密度离心法将淋巴细胞清除，否则癌细胞会被 杀死。(5) 实验要防止其他细胞株的交叉污染。2、在传代肿瘤细胞培养时应注意的问题(1) 当癌细胞没有生长到足够的量时，应耐心等待，坚持换液，不要急于传代。(2) 癌细胞经常重叠生长，如果混有成纤维细胞，应

23、在传代时采用消化消除法及反复贴 壁法加以清除，分离出癌细胞进行传代培养。(3) 在传到 10 代前细胞生长繁殖极不稳定， 传代要小心，该合并培养时还得合并，千万 不能传代。要确定适合该细胞的培养方法。(4) 在早期传代时要适当提高接种浓度。(5) 对于增殖能力极低的细胞，应放入饲养层中培养，并加入一些促生长物质，如胰岛 素、氢化考的松、雌激素、 EGF、软铁蛋白等因子。(6) 消除成纤维细胞始终为癌细胞培养中的重要条件，一旦发现应尽早尽快按上述介绍 的方法加以清除。(七) 人类恶性肿瘤连续性细胞系 (株)的建系 (株)标准1、共同特征能在体外培养半年以上 (或 20代以上) ，生长稳定，保持特性，能连续传代的，可称为 连续性细胞系 (株) 。要具备如下原始资料：(1) 标本来源 要记录患者姓名、年龄、性别、临床诊断的疾病类别和分期。(2) 标本收集日期、