培养细胞的观察与检测

1、 细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄是否更换等。细胞常规检查观察的内容为： 培养液的颜色和透明度的变化 正常情况下，培养液pH介于7.27.4之间，呈桃红色清亮透明。 随着细胞生长时间的延长，细胞代谢产生的酸性产物会使培养液pH值下降，引起颜色变浅变黄。 正常情况生长稳定的细胞23天换液一次，生长缓慢的细胞34天换液一次。 培养液中加培养液中加Hepes或用或用5%CO2温箱培养可使温箱培养可使pH维持稳定，利于细胞生长。用含磷酸盐缓冲系统维持稳定，利于细胞生长。用含磷酸盐缓冲系统培养

2、时，可因瓶及塞子漏气，培养时，可因瓶及塞子漏气，CO2溢出，也可能溢出，也可能由于培养瓶塞洗刷不洁、残留碱性物，使培养液由于培养瓶塞洗刷不洁、残留碱性物，使培养液变碱发红，只致使细胞难以生长，甚至死亡。细变碱发红，只致使细胞难以生长，甚至死亡。细胞换液传代后，胞换液传代后，若发现培养液很快变黄，若发现培养液很快变黄，要注意要注意是否有细菌污染或培养器皿没有洗干净。贴壁细是否有细菌污染或培养器皿没有洗干净。贴壁细胞培养时若出现混浊，多为污染。悬浮培养的细胞培养时若出现混浊，多为污染。悬浮培养的细胞，应将瓶竖起静置胞，应将瓶竖起静置1小时，若培养基混浊示为小时，若培养基混浊示为污染，也可在显微镜下

3、仔细观察有无污染现象出污染，也可在显微镜下仔细观察有无污染现象出现。现。 生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。 若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。 若细胞营养不良状况没有得到及时纠正，进一步发展可见到部分细胞死亡，崩解漂浮在培养液中。发现这种情况应及时处理，只有生长良好的细胞才能进行传代培养和实验研究。 细胞培养时，经初代培养或传代培养，都有一长短不同的潜伏期，在培养过程中注意观察细胞增殖生长的状态

4、极为重要。各种细胞增殖的时间不尽一致。传代细胞系，胚胎组织或幼体细胞潜伏期短，一般在接种培养第二天即可见细胞生长增殖，34天便可连接成片。成体组织的潜伏期长，老年组织和癌组织潜伏期更长，可达一周左右。 原代细胞培养中最先可见从组织块中边缘原代细胞培养中最先可见从组织块中边缘“长出长出”细胞，这种细胞是从原代组织块中游走出来的，细胞，这种细胞是从原代组织块中游走出来的，并不是细胞增殖产生。这种早期游出的细胞多以并不是细胞增殖产生。这种早期游出的细胞多以成纤维细胞为主，其易生长，适应性强，呈放射成纤维细胞为主，其易生长，适应性强，呈放射状或旋涡状分布，很快生长并互相连接成网状。状或旋涡状分布，很快

5、生长并互相连接成网状。传代细胞在传代后，一般经过悬浮、贴壁伸展很传代细胞在传代后，一般经过悬浮、贴壁伸展很快进入潜伏期，对数生长期，细胞大量繁殖，逐快进入潜伏期，对数生长期，细胞大量繁殖，逐渐相连成片而长满瓶底。一旦发现细胞长满瓶底渐相连成片而长满瓶底。一旦发现细胞长满瓶底80%就应及时传代，否则会影响细胞生长甚至脱就应及时传代，否则会影响细胞生长甚至脱落。悬浮细胞当发现生长显著、密度增大、分布落。悬浮细胞当发现生长显著、密度增大、分布稠密、培养液变黄时也应及时传代。稠密、培养液变黄时也应及时传代。 4、微生物污染细胞接种、传代、换液加药后应经常观察，密切注意是否有微生物污染发生。一旦发现培养

6、液混浊、液体内漂浮着菌丝或细菌，或生长明显变缓，胞质内颗粒增多，有中毒表现等应怀疑是否有微生物污染，进一步观察检查并及时处理。 生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后一。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退在细胞达到饱和密度后，

7、停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，需连续对细胞进行计数。通常计数需连续对细胞进行计数。通常计数7 d。为精确起见，一。为精确起见，一般每次计数般每次计数3瓶细胞并取平均值。典型的生长曲线可分为瓶细胞并取平均值。典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指教生长期，呈平台状的生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指教生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡平顶期及退化衰亡4个部分。以存活细胞数个部分。以存活细胞数(万万mL)对培对培养时间养时间(h或或d)作图，即得生长曲线。作图，即得生长曲线。 除使用计数法测定

8、细胞的生长曲线外，还可用除使用计数法测定细胞的生长曲线外，还可用MTr比色法比色法间接测量之。间接测量之。MTT比色法的主要原理是：比色法的主要原理是：MTr被活细胞中被活细胞中线粒体琥珀酸脱氢酶还原后，生成暗蓝色甲瓒，甲瓒被助线粒体琥珀酸脱氢酶还原后，生成暗蓝色甲瓒，甲瓒被助溶剂溶解后，可在酶标仪上读取光吸收值溶剂溶解后，可在酶标仪上读取光吸收值(OD)，在一定范，在一定范围内光吸收值围内光吸收值(OD)与活细胞数量呈线性关系。所以可以通与活细胞数量呈线性关系。所以可以通过测量过测量OD值，间接测量活细胞数量。值，间接测量活细胞数量。 生长曲线常用于测生长曲线常用于测定药物等外来因素对细胞生

9、长的影响。一般在对数生长期定药物等外来因素对细胞生长的影响。一般在对数生长期的的1/31/2处加药。细胞计数的时间和次数则依实验目的处加药。细胞计数的时间和次数则依实验目的而定。而定。 凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性。 细胞污染的分类 物理污染 化学污染 生物污染（支原体污染）控制污染 掌握良好的无菌操作技术 建立细胞库 合理应用抗生素 保持工作区清洁 建立良好的规章制度 检测细胞污染 1、污染途径空气：每立方米含菌数不应超过15个器材：操作：血清：组织样本： 生长缓慢，分裂相减少，细胞变粗糙，

10、轮廓增强，胞浆多生长缓慢，分裂相减少，细胞变粗糙，轮廓增强，胞浆多颗粒状物。重者细胞增殖停止，分裂相消失，胞质中出现颗粒状物。重者细胞增殖停止，分裂相消失，胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。大量堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。细胞污染的种类和判定细胞污染的种类和判定 细胞培养中常见的污染物有细菌、酵母菌、真菌、支原细胞培养中常见的污染物有细菌、酵母菌、真菌、支原体和病毒等。在出现以下情况时培养的细胞可能有污染：体和病毒等。在出现以下情况时培养的细胞可能有污染：培养液的酸碱度发生异常的改变。培养液的酸碱度发生异常的改变。培养液出现混浊。培养液出现混浊。光镜观察到菌丝和颗粒。光

11、镜观察到菌丝和颗粒。细胞出现死亡或增殖缓慢等。细胞出现死亡或增殖缓慢等。 3、污染物的检测、污染物的检测1）. 真菌污染真菌污染常见真菌种类：多为烟曲霉、黑曲霉、毛常见真菌种类：多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等真菌污染判断真菌污染判断：肉眼可见培养液中见白色或黄色漂浮物，肉眼可见培养液中见白色或黄色漂浮物，倒置镜下见细胞间纵横交错，丝状、管状、倒置镜下见细胞间纵横交错，丝状、管状、 树枝悬浮飘荡的菌丝或形态呈卵形，散在树枝悬浮飘荡的菌丝或形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长，细胞周边和细胞之间生长，培养液多不混浊。培养液多不混浊。 2）.

12、细菌污染细菌污染常见细菌种类：大肠杆菌、白色葡萄球菌、常见细菌种类：大肠杆菌、白色葡萄球菌、假单孢菌等假单孢菌等细菌污染判断细菌污染判断：培养液颜色变黄，出现混浊培养液颜色变黄，出现混浊镜下观察，大量圆球状颗立漂浮，细胞表镜下观察，大量圆球状颗立漂浮，细胞表面和周围有大量细菌面和周围有大量细菌细胞生长停止，并有中毒表现细胞生长停止，并有中毒表现 细菌和真菌污染的检测：涂片染色镜检；接种培养：Trypticase大豆肉汤、BHI、Thioglycocollate肉汤和血琼脂板适于广泛的细菌检测；Sabouraud肉汤、YM肉汤和营养肉汤适于检测真菌。检测到阳性结果后，应高压灭菌处理污染的培养物及

13、其用具 3）.支原体支原体: 常见而棘手。常见而棘手。支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞的抗原性，长，改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改变，干扰病毒的复制，引起细胞染色体改变，干扰病毒的复制，以及具有类病毒作用。在培养细胞初期，以及具有类病毒作用。在培养细胞初期，由于支原体对细胞的繁殖影响较小而往往由于支原体对细胞的繁殖影响较小而往往被忽略。被忽略。 支原体检测方法和处理：支原体检测方法和处理：荧光技术检测：支原体含有荧光技术检测：支原体含有DNA，能与荧光染料，能与荧光染料Hoechest33258特异性的结合，可

14、根据细胞表面特异性的结合，可根据细胞表面的荧光来显示细胞是否污染有支原体。的荧光来显示细胞是否污染有支原体。相差显微镜：相差油镜下呈暗色微小颗粒。相差显微镜：相差油镜下呈暗色微小颗粒。电镜观察：电镜观察：SEM，TEM。DNA分子杂交：检出率高但复杂。分子杂交：检出率高但复杂。检测完毕后，所有实验用具均应经过高压消毒处检测完毕后，所有实验用具均应经过高压消毒处理。理。 污染支原体后的处理：污染支原体后的处理：抗生素处理：如加入泰乐菌素等。抗生素处理：如加入泰乐菌素等。共培养法：与巨噬细胞共培养。共培养法：与巨噬细胞共培养。重新克隆法：抗生素处理后，将细胞稀释重新克隆法：抗生素处理后，将细胞稀释

15、后传代，每周换后传代，每周换2次含抗生素的新鲜培养液，次含抗生素的新鲜培养液，4-5周后，重复克隆周后，重复克隆2次。次。过滤法：过滤法：0.22µm孔径滤膜正压过滤。孔径滤膜正压过滤。 4）.污染病毒的检测污染病毒的检测致细胞病变效应（致细胞病变效应（CPE）或集落的检测：）或集落的检测：采用相差显微镜检测采用相差显微镜检测血细胞吸附试验；血细胞吸附试验；鸡胚接种。鸡胚接种。 为避免细胞间交叉污染，应注意：为避免细胞间交叉污染，应注意：了解各细胞系的特征；了解各细胞系的特征；培养各细胞系的操作手续要快速；培养各细胞系的操作手续要快速；培养各细胞系不用同一瓶的培养液和酶等；培养各细胞系不用同一瓶的培养液和酶等；吸过培养液和细胞悬液的吸管，不能放回储存培吸过培养液和细胞悬液的吸管，不能放回储存培养液和酶的瓶内；养液和酶的瓶内；经常检查培养物特征，注意任何突然的形态学改经常检查培养物特征，注意任何突然的形态学改变，通过染色