生物制品质量标准内容及结构确证内容

1、生物技术药物的质控体系质量标准研究内容检定方法、质控标准理化性质：外观（形状、颜色、气味）、pH 均一性：纯度、浓度 鉴别 结构确证 效价：生物学活性、免疫学活性 残余杂质：产品、工艺、环境相关的杂质 起草、制定制造与检定规程 研究建立国家标准品或参考品重组蛋白质药物质量标准研究效价：生物学活性与比活性 蛋白质纯度 蛋白质含量 理化性质鉴定（部分非常规） 残余杂质 安全性及其它项目一 生物学活性及比活性测定(一 检测意义获取准确的效价信息，保证产品有效效价：有效性指标，反映药品效力生物学活性才能真实反映生物技术药效价原因：生物制品分子大、结构复杂、不稳定，使得重量与效价不一致生物制品技术药：单

2、位（U 、AU 、IU ）（二） 生物学活性测定方法分类1、动物基础的活性测定离体动物器官法：脑利钠肽的兔主动脉体内测定法： EPO 的小鼠网织红细胞2、细胞基础的活性测定 促细胞生长法：大多数细胞因子类 抑制细胞生长法：细胞毒素、血管抑制剂 间接保护细胞法：IFN 保护WISH3、酶学基础的活性测定：重组酶类4、受体-配体、抗原-抗体结合基础的活性测定：抗原决定簇与活性中心常不一致（三）生物学活性测定方法选择1、细胞培养法离体器官法体内法2、细胞染色标记方法： MTT 3H-Thymidine 流式细胞仪 （测细胞周期、凋亡）3、定量法半定量法定性法4、生物学活性不一定与临床药效类型一致工艺

3、稳定、测生物活性特别复杂时，可替代。 如rh-GH 用HPLC（四）生物学活性测定（见药典附录C ）1、样品：原液、成品2、方法：如上述（好好研究？）3、标准：不同生物活性测定方法的规定标准测定方法 规定标准动物基础的活性测定 70%-130%标示量细胞基础的活性测定 80%-120%标示量酶学基础的活性测定 85%-115%标示量结合反应的活性测定 85%-115%标示量（五）蛋白质药物的比活性（见分生实验册77页）？1、样品：原液2、定义与计算：比活性：单位重量蛋白的活性单位数（IU/mg3、标准：不小于。IU/mg4、意义：1）真实反映有活性的蛋白质所占的比例厂家间、表达系统间、批间比较

4、2）便于配制成品二 蛋白质纯度检查 样品：原液 方法：必须采用二种方法测定非还原SDS-PAGE 法HPLC 法 标准：纯度均须达到95%或98%以上非还原SDS-PAGE 法测定纯度（见药典附录C ） SDS-PAGE ：据分子大小分离 样品处理：样品不加-ME 或DTT二硫键未打开，反映单体、二聚体或多聚体情况 染色方法与上样量银染: 5ug （检测限为1-10ng ）考马斯亮蓝R-250：10ug （检测限为0.1ug ） 定量方法：凝胶扫描 标准：无明显杂带，纯度95%或98%HPLC 法测纯度？（见药典附录B ） 分析柱：反相柱、离子柱、分子筛应尽量采用反相柱或离子柱应注明采用的分析

5、柱性质 上样量：5ug 标准：出峰时间正确 纯度：95%或98%三、蛋白质含量测定(见药典附录D 样品：原液、成品 方法：*Folin-酚试剂法（Lowry 法）：（见分生实验册67-73页）简便、灵敏、优先采用，灵敏度：5-100ug/ml*染色法（Bradford 法）：考马斯亮蓝G-250，简便灵敏， 25-200ug/mlBCA(二喹啉甲酸 法：操作简单，比Lowry 法快4倍且更加方便，准确灵敏：20200 ug/ml，微量BCA 的测定范围在0.510 ug/ml。经济适用 ，抗试剂干扰能力比较强。紫外分光广度法：用于原液比活性计算和成品规格控制四、蛋白质药物理化性质鉴定（一）特异

6、性鉴别试验1、样品：原液和成品2、方法：免疫印迹法Western Blot、 Dot Blot3、标准：应该阳性（二）相对分子量测定1、样品：原液2、方法：还原型SDS-PAGE （见分生实验册51页、见药典附录C ）、质谱法3、标准：1）理论值±10%范围2）批与批间一致（三）等电点测定（见药典附录D ）1、样品：原液2、方法：IEF ：常规等电聚胶电泳（见分生实验册55-57页）CE ：毛细管电泳3、标准：1）有明显主带2）理论值±0.5pH 范围3）批与批间一致（四）紫外吸收光谱分析（见药典附录A ）1、样品：原液2、方法：紫外扫描3、标准：1）最大吸收波长与特征波长

7、一致2）批与批间一致（五）肽图分析（非常规）（见药典附录E ）1、样品：原液2、方法：溴化氰/胰蛋白酶裂解+HPLC/ SDS-PAGE/CE/质谱法3、标准：1）有特征性图谱2）批与批间一致（六）氨基酸组成分析（非常规）1、样品：原液2、方法：HCl/NaOH水解（仅用于Trp 测定）+氨基酸自动分析仪3、标准：1）与理论值一致2）批与批间一致（七）氨基酸序列分析（非常规）1、样品：原液2、方法：N 末端： 15个残基，Edman 化学降解法，蛋白质全自动测序仪C 末端： 1-3个残基硫氰酸酯/羧肽酶降解法，RP-HPLC3、标准：1）与理论值一致2）批与批间一致（八）其它：二硫键、糖基化（

8、非常规）五、残余杂质检测（一）宿主相关杂质宿主细胞蛋白含量：（见药典附录C ）1、样品：原液、成品2、方法：双抗体夹心ELISA ：用HAS 作保护宿主蛋白标准品：中检所提供3、标准：1）大肠杆菌0.1%2）CHO 0.05%宿主细胞DNA 含量（见药典附录B ）1、样品：原液、成品2、方法：DNA 点印迹杂交法，地高辛标记DNA 标准品：厂家提供3、标准： DNA 含量10ng/剂量细菌内毒素含量（见药典附录E 凝胶限量实验）1、样品：原液、成品2、方法：鲎试剂分析法鲎试剂标准品：中检所提供3、标准：内毒素含量1/剂量（二）工艺相关杂质（见药典附录A ）如残余抗生素、IgG 、蛋白A 、小牛

9、血清（三）产品相关杂质如多聚体、不同的PEG 修饰产物六、安全性及其它检测项目（一）无菌试验平皿法，需氧菌、厌氧菌、真菌、支原体（二）热原试验鲎试剂法或家兔法（三）异常毒性试验小鼠（1ml 或豚鼠（5ml ），腹腔注射（四）水分、装量、pH 值原液质量标准 生物学活性、比活性（见药典附录C ） 蛋白质含量(见药典附录D 纯度：95%，非还原SDS-PAGE 法（见药典附录C ）、HPLC 法（见药典附录B ） 分子量：还原型SDS-PAGE 法（见药典附录C ）、质谱法 外源性DNA 残留量： 10ng/剂量（见药典附录B ） 宿主蛋白残留量: 0.1%，0.05%（见药典附录C ） 残余抗生素：不得检出（见药典附录A ） 细菌内毒素：10EU/剂量（见药典附录E 凝胶限量实验）结构确证：等电点（见药典附录D） （见药典附录 ） 、紫外吸收光谱扫描（见药典附录A） 末 、N 结构确证 （见药典附录 ）