荧光法测定醛糖还原酶活性的优化

1、荧光法测定醛糖还原酶活性的优化                         作者：王俊杰 方会龙 段小毛 肖和平 谷娟 李玲 欧阳冬生【摘要】 目的 找出优化NADP生成荧光法测定红细胞醛糖还原酶 (AR) 活性的方案。方法 通过研究血红蛋白浓度、激发荧光水浴时间以及NADP溶液贮存时间对荧光强度的影响，优化红细胞AR活性测定的NADP生成法；以此方法测

2、定正常及糖尿病大鼠AR活性。结果 NADP生成法的精确度受血红蛋白影响，在终止反应后的NADP溶液中加入250 l 6高氯酸沉淀血红蛋白可消除此影响；水浴激发荧光时间5、30、60 min，荧光值变异系数无差异；在激发荧光前将反应体系生成的NADP溶液贮存于-20的条件下至少可以稳定保存4 w。糖尿病大鼠AR活性明显高于正常对照组(P<0.05)。 结论 优化的NADP生成法可以更准确测定红细胞AR活性。 【关键词】 糖尿病；醛糖还原酶；荧光；活性 【Abstract】Objective To optimize the the NADPgenerating fluorimetric me

3、thod for aldose reductase (AR) activity. Methods The effect of haemoglobin，the time of aqueous bath arousing fluorescence and storage time of NADP solution on the fluorescent value was observed. It was optimized that the NADPgenerating fluorimetry assayed erythrocytes AR activity. AR activity of nor

4、mal and diabetic mellitus rat were examined.Results The accuracy of this assay was influenced by hemoglobin concentration which could be eliminated by adding 250 l 6 perchloric acid to precipitate hemoglobin as the reaction was terminated. It had no difference for the variation coefficient of fluore

5、scence value when the time that the fluorescence was provocated through waterbath was 5,30,60 min. NADP solution could be stored in the condition of -20 for 4 weeks at least. AR activity was higher in diabetic rats than that of normal rats(P0.05). Conclusions Optimized NADPgenerating fluorimetry can

6、 measure activity of erythrocyte AR accurately. 【Key words】Diabetes; Aldose reductase; Fluorescence；Activity醛糖还原酶(Aldose Reductase，AR)是葡萄糖代谢多元醇通路的限速酶，高血糖可激活AR，使葡萄糖经多元醇通路的代谢增强，造成山梨醇在细胞内的蓄积和还原剂如还原型辅酶 (NADPH) 的缺失，导致细胞膜的结构和功能受损而干扰细胞的正常代谢。动物和临床实验均提示，高血糖激活AR是糖尿病并发症的主要发病机制之一1。最新研究发现AR还在心肌缺血2及内毒素引起的休克反应3中发挥

7、着重要作用。因此，测定红细胞AR活性，对研究AR与相关疾病发病机制的关系具有重要意义。目前测定AR活性有荧光法和比色法。红细胞AR活性测定多采用荧光法4，其原理为NADP与强碱作用产生荧光信号，其强度与NADP的浓度成正比，咪唑可保护荧光的稳定性，当定量且过量的NADPH存在时，以DL甘油醛为底物，可通过测定NADP的生成或NADPH的减少来反映AR活性。新近有研究显示NADP生成法灵敏度和重复性更好5，为此，我们对该方法进行了优化。1 材料与方法1.1 动物及分组雄性10周龄SD大鼠20只，由中南大学动物实验中心提供，随机分成2组：对照组和糖尿病组。1.2 方法NADPH(纯度>98，

8、ROTH公司)，NADP(纯度>90，ROTH公司)，DL甘油醛(Wako公司)，链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，其他试剂均为国产分析纯。荧光分光光度计(日本产岛津RF5000)，京都血糖仪(日本第一科学株式会社)。                             大鼠适应性喂养3 d，禁食12 h

9、，糖尿病组按5.5 ml/kg体重单次腹腔注射STZ溶液 (STZ用0.1 mol/L pH4.2的柠檬酸缓冲液配成10 mg/ml的溶液)，3 d后尾静脉采血随机测血糖13.5 mmol/L者为糖尿病大鼠，对照组注射等量柠檬酸缓冲液。饲养期间所有大鼠自由饮水进食。4 w后眼眶采血，血糖仪测定血糖。4 w后，眼眶采血，取肝素抗凝血1 ml，3 000 r/min×10 min分离红细胞，然后加4倍体积4预冷的生理盐水，3 000 r/min×10 min×3 次离心洗涤红细胞，按照50 l/支分装 (一支实验管，其余备用)，-20冻存。取冻存红细胞加200 l 1

10、0 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 6.0)，振荡溶解10 min，3 000 r/min×10 min，去沉淀。甘油醛，150 mol/L NADPH，5 l红细胞溶血液，总体积200 l。实验管加上述所有试剂，空白管以去离子水代替NADPH。加入DL甘油醛后立即37水浴反应。5 min后，将样本同时放入冰浴中，加入600 l 0.5 mol/L HCl后60水浴15 min来终止反应并破坏反应剩余的NADPH。冰浴冷却后加入250 l 6高氯酸3 000 r/min×10 min离心沉淀血红蛋白，吸取上清1 ml，-20冻存。加入2 ml 6 mol/L NaOH (内

11、含10 mmol/L咪唑) 37水浴5 min激发NADP产生荧光，Ex360 nm/Em460 nm测定荧光强度。用高铁氰化血红蛋白法。实验管加稀释液3 ml，红细胞溶血液12 l，空白管以去离子水代替红细胞溶血液，混匀，静置5 min，以空白管调零测实验管在540 nm的吸光度值，计算血红蛋白含量Hb(g/L)OD540×367.7。每份样品平行做三份取均值。反应体系与条件同上，去离子水代替红细胞溶血液，NADP(01 000 mol/L) 代替NADPH，以NADP浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标做标准曲线，求回归方程。由方程求得NADP生成量，以每分钟产生1 mol NADP为

12、1个酶活性单位(U)，计算AR活性。按照以上实验方法分别测定在加入2.5、4、5、6、10 l同一红细胞溶血液的情况下激发的荧光强度；在终止反应后的NADP溶液中未加入250 l 6高氯酸沉淀血红蛋白，然后测定激发的荧光强度。以同一溶血液为标本，测定反应体系生成的NADP溶液在-20冻存0、4、24 h，1、2、4 w后的NADP激发的荧光强度。37水浴5 min后测量NADP产生的荧光值；37水浴30 min后测量NADP产生的荧光值；37水浴60 min后测量NADP产生的荧光值。1.3 统计学分析实验结果用x±s表示，两样本均数比较用t检验，多样本均数比较(成组设计)用单因素方

13、差分析。统计分析采用SPSS12.0统计软件包。2 结 果2.1 标准曲线与回归方程NADP标准曲线的回归方程：荧光强度=2.828+1.419×NADP浓度，则NADP浓度=(荧光强度-2.828)/1.419。2.2 血红蛋白对AR活性测量值的影响在未去除血红蛋白的条件下，红细胞溶血液在2.510 l的范围，荧光强度随红细胞血红蛋白量的增加而降低；在终止反应后的NADP溶液中加入250 l 6高氯酸沉淀血红蛋白，荧光强度随红细胞溶血液的含量升高而升高，提示红细胞对荧光测量值有较大干扰。红细胞溶血液2.5、4、5、6、10 l各组未去除血红蛋白测定的荧光值均低于去除血红蛋白测定的荧

14、光值(P<0.05)，见表1。表1 红细胞溶血液在去除和未去除血红蛋白条件下激发的荧光强度(略)                             2.3 样本的保存周期-20冻存4、24 h，1、2、4 w后的NADP溶液测定的荧光强度分别是：45.2±1.7，44.2±1.3，45.

15、4±1.9，44.1±2.1，44.4±2.3与对照组(44.9±1.2)比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.4 激发荧光的水浴反应时间对荧光强度的影响生成的NADP溶液加入含咪唑的NaOH后，在37水浴分别放置5、30、60 min激发荧光值，各组间总体均数差异均有统计学意义(P<0.05)，各组间变异系数的差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。表2 激发荧光的不同水浴时间测量的荧光强度(略)2.5 各组大鼠血糖和红细胞AR活性比较糖尿病大鼠造模4 w后血糖为(22.72±3.42) mmol/L与对照组血糖(6.

16、25±1.04) mmol/L比较显著升高（P<0.05）。糖尿病大鼠AR活性(5.64±2.28) U/mg较对照组(1.45±0.98) U/mg显著升高（P<0.05）。3 讨 论 红细胞AR活性测定常采用荧光法，本实验中采用的是NADP生成荧光法，其测定步骤为：一定时间内的反应，终止反应，激发荧光并测定荧光值，根据标准曲线、荧光值和蛋白含量计算AR活性。体外测定AR活性的原理是，AR使底物DL甘油醛转化为DL甘油酸的同时，NADPH被氧化成NADP，NADP可进一步与强碱作用产生荧光，荧光强度与其浓度成正比，加入咪唑可以在一定时间内防止荧光强度

17、衰减。因此通过测定NADP生成可以反映AR的活性。 本研究结果显示，红细胞溶血液在2.510 l范围内，未去除血红蛋白测定的荧光值均低于去除血红蛋白测定的荧光值，且随着红细胞溶血液的浓度增大，荧光值的差异也越大，提示血红蛋白对荧光值影响较大，推测可能是由于血红蛋白上的亚铁离子与NADP发生氧化还原反应而减弱了荧光。终止反应后用6%高氯酸沉淀血红蛋白可以避免荧光值的消减。 反应体系生成的NADP溶液是否能长期保存目前未见报道，我们的研究结果发现，NADP溶液经过4、24 h、1、2、4 w的贮存时间后激发荧光强度无统计学差异。建议实验可以分段进行，以提高效率，特别适合需要在别处使用荧光分光光度计

18、的实验室。 目前测定红细胞AR活性的方法中，激发荧光的水浴反应时间主要有5、30、60 min。结果显示，37水浴5 min 荧光强度已接近最大值，560 min激发的荧光值逐渐增大。530 min比3060 min AR活性变化的趋势缓和，60 min的标准差高于5和30 min，但变异系数的差异无统计学意义。但为提高实验效率，建议采用37水浴5 min的实验方案。 AR活性是通过AR催化底物DL甘油醛反应5 min后辅酶的改变来计算的。加入底物DL甘油醛开始计时，37水浴5 min加入HCl终止反应后停止计时。由于一次有多个样本需要终止反应。因此建议样本在37水浴进行反应后，样本同时置于冰

19、浴中再加入HCl终止反应，可减小实验误差。 由于实验条件和方案的不一致，AR活性测量值会有差异，用优化后AR活性测定的NADP生成法能够准确反映糖尿病大鼠红细胞AR活性的变化。【参考文献】 1 YabeNishimura C.Aldose reductase in glucose toxicity：a potential target for the prevention of diabetes complicationsJ.Pharmacol Rev，1998；50(1)：2133.2 Kariserova K，Srivastava S，Hoetker JD.Redox activation of aldose reduc