蛋白质二硫键异构酶既是酶又是分子伴侣

1、第43卷 第13期科 学 通 报1998年7月专题评述蛋白质二硫键异构酶既是酶又是分子伴侣王志珍(中国科学院生物物理研究所,生物大分子国家重点实验室,北京100101)第43卷 第13期专题评述科 学 通 报1998年7月一样促进多肽链折叠成其天然构象?PDI存在于内质网管腔内,含量丰富,占到细胞总蛋白的014%.它是一个非常特殊的多功能蛋白,而且具有显著的非特异的多肽结合能力,这正是一个蛋白质分子可能成为分子伴侣所必备的重要条件.考虑到PDI的这些特性,我们于1993年提出了/蛋白质二硫键异构酶既是酶又是分子伴侣0的假说6.不久,国际上其他实验室也提出类似的看法79.此后,越来越多的体内外实

2、验数据都支持这一假说.曾与Anfinsen一起在美国国立健康研究院研究蛋白质折叠的AlanSchechter,在1995年为Anfinsen逝世所写的悼文中说/实际上,正是Chris和他的同事FrancodeLorenzo,DavidGivol,SaraFuchs,最早确定并描述了分子伴侣,蛋白质二硫键异构酶010.近年来,已有几篇综述涵盖了PDI这一热门研究领域的诸多方面4,69,1113,本文仅在此讨论PDI的分子伴侣活性以及酶与分子伴侣的关系.1 PDI的分子伴侣活性是独立于它的二硫键异构酶活性的固有性质1.1 PDI帮助不含二硫键蛋白在体外的折叠如上所说,多肽链的折叠和二硫键的形成是两

3、个密切相关、协同运作的过程.如果用含二硫键的蛋白做靶蛋白,很难确切地将PDI可能具有的分子伴侣活性与它的异构酶活性区分开.因此我们选用不含二硫键的蛋白质)3_磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)14和硫氰酸酶15,作为靶蛋白来检查PDI是否确实具有固有的、在一般意义上的帮助变性蛋白进行重折叠的能力.这两种蛋白作为靶蛋白还有一个好处,是它们在完全变性后都表现很低的自发复性能力,而且在复性过程中表现严重的聚合倾向,因此更容易看出PDI对它们复性的影响.有趣的是,在嗜热古细菌Sulfolobussolfataricus中发现的一种催化二硫键形成的酶,在帮助它自己的乙醇脱氢酶和谷氨酸脱氢酶折叠时的表现与分子

4、伴侣十分相似,而这两种脱氢酶也是不含二硫键的17.1.2 酶活性部位_CGHC_不是PDI的分子伴侣活性所必需的PDI分子由a,b,bc,ac,c5个结构域顺序排列组成.a和ac分别具有1个与硫氧还蛋白相似的_CGHC_序列,是其异构酶的活性部位.Gilbert小组报道,活性部位是其分子伴侣活性与酶活性都必需的.我们对活性部位中的巯基进行化学修饰,并直接比较PDI的烷基化对其异构酶和分子伴侣活性的作用.结果表明化学修饰使异构酶活性几乎全部丧失,但并不影响PDI的分子伴侣活性.烷基化的PDI(mPDI)加入到变性GAPDH的再折叠体系中,表现出与天然PDI极其相似的作用,增加GAPDH的复性,减

5、少复性过程中的聚合,说明PDI的1816第43卷 第13期科 学 通 报1998年7月专题评述分子伴侣活性与酶活性部位无关19.1.3 没有异构酶活性的突变PDI具有重要的生物功能最近日本一个实验室发现,2个活性部位的_CGHC_都被_SGHC_代替的突变体,其异构酶活性完全丧失,但仍然可以与野生型PDI一样,在酵母中促进与其共表达的人溶菌酶的正确折叠和分泌22.PDI是脯氨酸_4_羟化酶A2B2的B亚基,它的作用主要是防止A亚基的错误折叠和聚合.有意思的是2个活性部位都被_SGHC_取替并丧失异构酶活性的B亚基,仍然可以像野生型一样与A亚基结合而形成具有全部活力的脯氨酸_4_羟化酶A2B2,

6、说明PDI在羟化酶四聚体的组装过程中,不是异构酶活性而可能是分子伴侣活性在起作用23.相似的情况还有Wetterau的实验.微粒体甘油三酯转运蛋白复合体由PDI与另一个97ku的亚基组成,97ku成分一旦与PDI解离就会发生聚合.而2个催化部位都被_SGHC_取替而失活的PDI与97ku共表达仍能形成有活力的甘油三酯转运蛋白复合体24.当然,在这两种情况中,PDI是最终有功能结构的组成成分,这一点与典型的分子伴侣不同,但它确是功能蛋白的组装所必需的,而且起作用的恰恰不是它的异构酶活性.2 PDI的多肽结合位点负责其分子伴侣活性PDI对多肽有低特异性的结合能力,至少有1个多肽结合位点已经被确定位

7、于c结构域,推测它与其分子伴侣功能有关25.如前面所提到的,保留了1个_CGHC_活性位点但缺失多肽结合位点的突变PDI,无法使酵母存活21.最近,我们实验室在E.coli中表达了一种人PDI的突变体,其C末端与多肽结合有关的51个氨基酸残基被删除.这种突变体(abbcac)既不表现多肽结合能力,在帮助变性GAPDH重折叠的过程中也不再表现出分子伴侣的活性;但仍表现出大部分酶活力,可以催化胰岛素还原和催化因二硫键错配而失活的核糖核酸酶的异构体复性.这为PDI分子c结构域的多肽结合位点负责其分子伴侣活性提供了直接的证据26.类似的,硫氧还蛋白虽然有1个相似的_CGPC_活性位点但缺乏多肽结合能力

8、,即使很高的浓度对GAPDH的重折叠也不表现任何效果19.非特异的多肽与靶蛋白竞争结合PDI,可阻碍PDI所帮助的靶蛋白的再折叠,同时还阻碍PDI抑制变靶蛋白聚合的作用,这证实了第43卷 第13期专题评述科 学 通 报1998年7月多肽结合位点对其分子伴侣活性所起的重要作用19.细菌中PDI的对应物是DsbA,其高分辨率3_D结构表明它具有多肽结合位点.在GAPDH的重折叠体系中,我们发现增加非特异多肽的浓度确也降低DsbA帮助GAPDH重折叠的分子伴侣作用27.胰腺特有的PDI虽然也有2个与硫氧还蛋白类似的活性中心(_CGHC_和_CTHC_),但其C末端没有一般PDI所具有的富含酸性氨基酸

9、的多肽结合结构域,因此酶活力很低.多肽结合区N端的3个氨基酸残基缺失后便不能与A亚基结合而形成有活性的脯氨酸_4_羟化酶四聚体29.283 PDI的折叠酶活性由其异构酶和分子伴侣两种活性共同组成4 PDI在体内外都表现为不仅仅是一个异构酶PDI可与非天然构象的蛋白质以及分泌蛋白相结合.根据分子伴侣具有选择性地与去折叠蛋白结合,经ATP水解又可与之解离的性质,Nigam等人31建立了一种亲和层析方法,用以分离内质网中具有分子伴侣性质的蛋白质.结果,内质网中已被鉴定的分子伴侣以及硫氧还蛋白家族成员PDI和ERp72等,都被亲和层析分离出.Roth和Pierce32用体内交联的方法证实了PDI与免疫

10、球蛋白形成的复合体,表明PDI与在内质网内进行折叠的蛋白质可以相互作用发生瞬间结合.Otsu等人33的结果表明,PDI在体内可与错误折叠的人溶菌酶结合,但不和天然酶结合,他们认为这与PDI可能具有的分子伴侣功能,而不是异构酶功能相关.Chessler和Byers34发现,因突变而呈反常构象的Ñ型原胶原蛋白三体与PDI形成稳定的复合物,表明PDI能特异识别和结合在内质网中折叠错误的胶原蛋白分子,并把它们保留在内质网中.像内质网中其他/应激蛋白0,如Bip和calreticulin一样,PDI也会因为分泌蛋白的过量合成,或未折叠好的和错误折叠的蛋白在内质网中的积累,而被诱导表达35.最近

11、还观察到无论是组织非特异性PDI还是胰腺特异性PDI,都可与处在转运后期阶段的一些分泌蛋白,包括不含有半胱氨酸残基的蛋白,发生瞬间的接触.表明PDI在蛋白质的与翻译同时进行的以及翻译后进行的转运过程中起着重要的作用,这种作用可能正是与它的分子伴侣活性有关36.在完整的细胞中或是在体外,PDI都可催化人绒毛膜促性腺激素A和B亚基的组装而并不成为组装完成后的活性激素分子AB的组成部分.有意思的是不完全折叠的B亚基比其全部二硫键都形成的B亚基更有组装能力,它可与PDI优先结合37.第43卷 第13期科 学 通 报1998年7月专题评述Guntere等人38报道,哺乳动物PDI家族的成员PDI和Erp

12、72,能够取代Trgl对酵母生存至关重要的一些功能,他们认为这是为Trgl/Pdi1蛋白可能具有的对巯基特异的分子伴侣功能提供的线索.Ostermeier等人39认为,在E.coil中与PDI共表达的牛胰蛋白酶抑制剂的表达水平增高,是因为PDI的类似分子伴侣的作用.Nakamura等人40认为,PDI催化混合二硫键的还原断裂,是通过其类分子伴侣的性质,即PDI与蛋白质发生非共价的相互作用而改变其构象,以利于二硫键的还原及形成.他们还发现2个活性部位_CGHC_被_SGHC_取代的突变PDI尽管不能帮助其他谷胱甘肽衍生物的解离,仍然维持其正常的识别能力和类分子伴侣功能.在最近的一篇关于蛋白质有助

13、折叠的综述中,PDI和PPI都已被认为是内质网中的分子伴侣41.但也有一些作者,如Chivers等人42认为PDI的基本功能是由其类硫氧还蛋白结构域进行的催化作用,其分子伴侣功能似乎是不重要的和不必需的.5 PDI帮助蛋白质折叠的作用模式像其他分子伴侣一样,PDI识别未折叠好的或部分折叠的新生肽折叠中间物的非天然结构,或变性蛋白在重折叠过程中形成的折叠中间物的非天然结构,通过其多肽结合部位与之结合,从而防止靶蛋白或底物蛋白之间错误的结合和聚合.ATP通常是大多数分子伴侣,如Hsp6043和Hsp7044,赖以释放并帮助靶蛋白进一步折叠所必需的.因此和这一类ATP依赖型分子伴侣不同,PDI与其靶

14、底物的结合可能是瞬间的,而且复合物的解离不需要ATP,以这样不断进行的快速结合又解离的相互作用来阻止新生肽链间的无效相互作用,即导致聚合以及进一步降解的错误相互作用.这种情况可能与另一类分子伴侣,如Hsp9045相似.PDI与靶蛋白的短暂结合促进它们正确地折叠成类似天然的构象,这样对应的巯基才可能在空间上接近到可以通过氧化反应而形成天然的二硫键,这就是通常公认的PDI的异构酶功能.PDI具有非特异的多肽结合能力并不值得奇怪,因为这种能力正是分子伴侣必需的分子基础.PDI的分子伴侣活性和异构酶活性是相互独立的,但这两种活性很可能又是在靶蛋白折叠过程的不同阶段协同发挥作用.在折叠过程的早期,PDI

15、可能主要是作为分子伴侣防止部分折叠的肽链由于错误相互作用导致的聚合;在后期,当多肽链已经折叠到一定程度,PDI的基本功能则表现为异构酶,即催化配对巯基的氧化联接或错接二硫键的异构.6 ATP依赖型蛋白酶的分子伴侣活力第43卷 第13期专题评述科 学 通 报1998年7月蛋白酶的分子伴侣活力对其水解蛋白质的反应是很重要的,通过负责多肽结合的结构域与底物的相互作用,并以类分子伴侣的作用促进靶蛋白的构象重建和重折叠.对于Lon家族的蛋白酶来说,去折叠过程是高效酶解反应的一个重要部分.事实上,经典的分子伴侣也参与蛋白质水解反应.因此,生物体利用分子伴侣和蛋白酶这两种活力的共同作用,不管它们是位于同一肽

16、链还是在不同的肽链中,通过酶降解反应除去错误折叠的蛋白而对生物合成的蛋白质进行有效的质量控制.蛋白酶和其底物形成的复合物有不同的结构,这将决定它是被蛋白酶识别而被降解,还是被分子伴侣识别而折叠成天然结构.7 有酶活力的分子伴侣DnaJ是了解甚多的一种与蛋白质折叠和应激复性有关的大肠杆菌分子伴侣.它具有类似硫氧还蛋白的活性中心,这是一段具有4个_CXXCXGXG_重复序列的半胱氨酸富集的区域,其中_CPHC_序列与PDI家族的另一个成员DsbA的活性中心相同.最近,DnaJ被发现与PDI一样能催化蛋白质二硫键的氧化、还原和异构48.推测DnaJ是通过保持蛋白质在跨膜转运之前的还原状态,以及控制膜

17、蛋白插膜之前和插膜过程中内膜蛋白的氧化还原状态,参与蛋白质的转运.除了帮助蛋白质折叠和应激保护作用之外,DnaJ还能作为叶绿体硫氧还蛋白参与一些细胞酶活力的氧化还原状态的控制.8 讨论现在我们已经注意到上面讨论的这些不同类型的酶,蛋白质二硫键异构酶、ATP依赖型蛋白酶、触发因子和DnaJ,它们以类分子伴侣的方式与底物结合来提高酶的效率,这实在是一种非常重要而又聪明的办法.分子伴侣帮助酶的底物去折叠或折叠,为酶提供了一个效率大大提高的作用机制.与硫氧还蛋白相比,PDI在进化过程中又获得了一个_CXYC_的结构域和另一个多肽结合结构域,因此使PDI能同时具有异构酶活力和分子伴侣活力,更有效地行使其

18、折叠酶的功能.而硫氧还蛋白既没有多肽结合能力也没有分子伴侣活力,它的异构酶活力也比PDI要低很多49.与此类似的是,触发因子对于大蛋白底物比小分子PPI更有效.最近发现的一组新的小分子PPI,Parvulins,对小肽比对大蛋白底物更有效.如果设想那些与蛋白质折叠或去折叠有关的酶分子在进化过程中加上结合多肽的结构域或亚基用以提高酶的催化效率,特别是对大蛋白底物,应该是很有道理的.F1_ATP酶A亚基的抗体能识别线粒体内分子伴侣的事实,证明ATP酶家族蛋白和分子伴侣在进化上的关系50.同一分子具有分子伴侣和酶两种活力,使蛋白质分子具有更高的效率,或赋予它新的功能.ATP依赖型蛋白酶就第43卷 第

19、13期科 学 通 报1998年7月专题评述是通过选择性降解错误折叠的蛋白质而获得质量控制的新功能.致谢 作者真诚地感谢邹承鲁院士对本工作的不断鼓励和关心,以及蔡晖、姚怡、宋九莉、权晖、戴勇等同学的学位论文研究对本文的贡献.本工作为国家攀登计划和国家自然科学基金(批准号:39470163)资助项目.参 考 文 献4 FreedmanRB,HirstTR,TuiteMF.Proteindisulphideisomerase:buildingbridgesinproteinfolding.TrendsBiochemSci,1994,19:3313368 PuigA,GilbertHF.Protein

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