活血潜阳方对自发性高血压大鼠心肌肥厚组织原癌基因cfos和cmyc表达的影响

1、活血潜阳方对自发性高血压大鼠心肌肥厚组织原癌基因cfos和cmyc表达的影响         09-08-13 15:51:00     编辑：studa20                    作者：符德玉, 王世红, 周端, 马宇滢, 金露, 祖亮华 【摘要】 

2、目的：通过分析左心室心肌原癌基因cfos和cmyc mRNA及蛋白的表达，探讨活血潜阳方改善自发性高血压大鼠（spontaneous hypertensive rat, SHR）左心室肥厚的作用机制。方法：以10周龄的SHR为高血压左心室肥厚模型，随机分为SHR模型组，中药大、中、小剂量治疗组，西拉普利治疗组，年龄和性别相匹配的京都（WistarKyoto, WKY）大鼠作为正常对照组，每组5只。灌胃14周后，取大鼠心脏组织，用原位杂交组织化学法和免疫组化法分别检测心肌cfos和cmyc mRNA及蛋白的表达。结果：24周龄模型组SHR左心室肥厚心肌的原癌基因cfos和cmyc mRNA及蛋白

3、的表达与WKY大鼠比较明显增强（P<0.01）。与SHR模型组比较，大、中和小剂量活血潜阳方组大鼠左心室心肌组织中cfos和cmyc mRNA的表达下降（P<0.05）；大、中剂量活血潜阳方可降低cmyc蛋白的表达，但对cfos蛋白表达的影响与模型组比较，差异未见统计学意义。结论：活血潜阳方可以下调SHR心肌组织中原癌基因cmyc的表达，可能是改善高血压左心室肥厚的重要机制之一，是否通过对cfos表达的影响治疗左心室肥厚尚不能确定。 【关键词】  左心室肥厚; 自发性高血压大鼠; 活血潜阳方; 原癌基因蛋白质cfos; 原癌基因蛋白质cmycObjective: To e

4、xplore the possible mechanism of Huoxue Qianyang Formula (HXQYF), a compound traditional Chinese herbal medicine, in reversing the left ventricular hypertrophy (LVH) of spontaneous hypertensive rats (SHRs) by analyzing the expressions of mRNAs and proteins of protooncogenes cfos and cds: The experim

5、ental study was carried out in SHRs, the sex and agematched WistarKyoto (WKY) rats were served as normal control (n=5, normal saline 10 ml/kg daily). Twentyfive SHRs were randomly divided into five groups: untreated group (n=5, normal saline 10 ml/kg daily), highdose HXQYFtreated group (n=5, 0.84 g/

6、ml HXQYF, 10 ml/kg daily), mediumdose HXQYFtreated group (n=5, 0.42 g/ml HXQYF, 10 ml/kg daily), lowdose HXQYFtreated group (n=5, 0.21 g/ml HXQYF, 10 ml/kg daily) and cilazapriltreated group (n=5, 1 mg/ml cilazapril, 10 ml/kg daily). The drugs were intragastrically administered once daily for 14 wee

7、ks. The expressions of mRNAs and proteins of protooncogenes cfos and cmyc in left ventricular muscle were detected separately by in situ hybridization histochemical method and immunohistochemical method.Results: Compared with the normal control group, the expressions of mRNAs and proteins of protoon

8、cogenes cfos and cmyc in left ventricular muscle were significantly increased in untreated group (P<0.01). After treatment, the expressions of cfos and cmyc mRNAs in left ventricular muscle in HXQYFtreated groups were significantly downregulated as compared with those of the untreated group (P<

9、;0.05). The expressions of cmyc protein were also significantly decreased in high and mediumdose HXQYFtreated groups as compared with the untreated group (P<0.05), but it had no significant effects in protein expression of cfos in the three HXQYFtreated groups.Conclusion: HXQYF can inhibit the ex

10、pression of cmyc in ventricular hypertrophy tissue, which may be the mechanism in treating LVH of hypertention.Keywords: hypertrophy, left ventricular; rat, spontaneous hypertensive; Huoxue Qianyang Formula; protooncogene protein cfos; protooncogene protein cmyc    高血压左心室肥厚（left ventr

11、icular hypertrophy, LVH）是高血压病治疗中亟待解决的重要环节1。cfos和cmyc为即刻早期癌基因，是诱发心肌肥厚的始动因子2。现代医学研究表明，cfos和cmyc表达的变化，可能是心肌肥厚信号介导过程的一部分3, 4。有人推荐cfos和cmyc在临床基础研究中，可作为心肌肥厚存在的分子生物学标记。既往研究显示，具有活血化瘀、平肝潜阳和祛痰功效的活血潜阳方可降低高血压患者的左心室肥厚程度5。本研究进一步观察活血潜阳方对自发性高血压大鼠（spontaneous hypertensive rat, SHR）左心室心肌原癌基因cfos、cmyc基因和蛋白表达的影响，以期为中药治

12、疗高血压LVH的临床应用提供理论依据。1  材料与方法1.1  实验材料1.1.1  实验动物 SHR 10周龄，25只，体质量（194±49）g，正常京都（WistarKyoto, WKY）大鼠，10周龄，5只，体质量（250±78）g，均由上海市高血压研究所提供（许可证号：SHR 02371，WKY 02372）。1.1.2  药物与主要试剂 活血潜阳方（Huoxue Qianyang Formula, HXQYF），由丹参、水蛭、钩藤和石决明等组成，由岳阳医院制剂室制成浸膏，每克含生药8 g。用蒸馏水制成大、

13、中、小浓度溶液。西拉普利片（2.5 mg/片）由上海罗氏制药有限公司生产，批号为国药准字X19990244，用蒸馏水配制成1 mg/ml浓度溶液。cfos 和cmyc多克隆抗体，Santa Cruz公司生产，工作浓度为1100；生物素化抗地高辛抗体1500稀释，购自罗氏公司；EnVision试剂， Dako公司生产。cfos和cmyc多相寡核苷酸探针，博士德公司生产，均为地高辛标记；聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X100），国药集团。无酶水和0.1%焦碳酸二乙脂（diethyl pyrocarbonate, DEPC）水放置12 h后，高压灭菌30 min备用。1.1.3  实验

14、仪器 自动切片机，日本AIWA公司生产；OLYMPUS BH2型显微镜，日本奥林巴斯公司生产，稳定电压为4.03 V；透射电镜，日立H600型；Panasonic摄像机，分辨率480线，日本松下公司生产；IMS细胞图像分析系统，免疫组化定量分析软件，上海申腾信息技术有限公司生产。1.2  实验方法1.2.1  分组及用药 SHR随机各分为5组，每组5只（4雄、1雌）。具体分为SHR模型组，中药大（生药浓度0.84 g/ml，相当于成人剂量的24倍）、中（生药浓度0.42 g/ml，相当于成人剂量的12倍）和小（生药浓度0.21 g/ml，相当于成人剂量的

15、6倍）剂量治疗组，西拉普利组。WKY大鼠5只（4雄、1雌）作为正常对照组。按10 ml/(kg·d)不同药液灌胃，模型组和WKY组予等量蒸馏水灌胃。其中活血潜阳方低剂量组死亡1只（雌）。1.2.2  标本采集 各组喂养14周后，称取体质量，给予3戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉动物，即刻取出心脏，进行主动脉逆行灌洗（4 生理盐水），即刻（5 min内）以无酶水配制的4%多聚甲醛固定液固定，固定液容量为组织块体积的10倍。每组有3只（2雄、1雌）大鼠的心脏进行cfos、cmyc免疫组化及原位杂交实验（余进行胶原、的基因和蛋白表达实验，文章待发表）；每只大鼠

16、每个指标取3张切片（共得9个数据）。操作时需无菌，取材器械事先进行高压灭菌，尽量做到无RNA酶，固定标本后尽早进行石蜡包埋。1.2.3  免疫组化法检测心肌组织cfos和cmyc蛋白表达  左室游离壁，常规固定，石蜡包埋，切片，石蜡切片以二甲苯脱蜡及梯度酒精（无水酒精至50%）脱水。pH 6.0柠檬酸缓冲液入微波炉煮沸8 min，PBS缓冲液冲洗3次×3 min，0.3%过氧化氢甲醇液阻断内源性过氧化物酶，室温下20 min，PBS冲洗3次×3 min，正常动物血清保护，室温下20 min，滴加cfos 和cmyc抗体，平放于湿盒内，37 孵育1.5 h

17、，PBS冲洗3次×3 min，滴加EnVision，放入湿盒内，室温下30 min，PBS冲洗3次×3 min，二氨基联苯胺（diaminobenzidine, DAB）显迹，苏木素染核1 min，1%盐酸酒精分化，流水冲洗蓝化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察心肌细胞，核棕黄色者为阳性细胞。1.2.4  原位杂交法检测心肌组织cfos和cmyc mRNA表达 左心室游离壁，无RNA酶的条件下固定、浸蜡包埋。石蜡切片二甲苯脱蜡及梯度酒精脱水，PBS洗2次×3 min；切片入0.01 mol/L Triton X100内10

18、min，PBS洗2次×3 min ；经1% H2O2处理抑制内源性过氧化物酶，蛋白消化，终止消化后，切片放入0.01 mol/L pH 6.0柠檬酸缓冲液中，微波炉档（98 ）加热10 min，冷却，PBS洗3次×3 min，预杂交2 h，42 ，不洗，在杂交液中加入多相寡核苷酸探针4 g/ml，20 l/片，杂交1218 h，上覆盖蜡膜防蒸发，湿盒内加入少量甲酰胺缓冲。杂交后42 柠檬酸缓冲液系列洗脱，再进行生物素化抗地高辛抗体信号放大检测，0.04% DAB+0.03% H2O2，显色812 min，苏木素衬染30 s，水洗，盐酸乙醇分化，水洗片刻，微波蓝化，常规树脂封片。观察心肌细胞核棕褐色者为阳性细胞。对照设计：阴性对照用不加探针的杂交液杂交，用PBS