光引发聚合改性明胶用于牙组织工程的方法观察论文

1、光引发聚合改性明胶用于牙组织工程的方法观察论文2019-11-08组织工程化牙髓牙本质复合体常用的支架材料有轻磷灰石（hydroxyapatite, HA）-磷酸三钙（tricalcium phosphate TcP）、纳米碳 化硅（silicon carbide, sic）增强 HA 复合材料，明胶、胶原、屮壳素等，三 维支架为新生组织提供了生长空间，支持细胞生长，增殖并模拟胞外基质的许 多功能。明胶被广泛用作生物医用材料，但其凝胶性不耐久，35C 以上即溶化 为溶胶态。如果利用明胶侧链基团反应活性高的性质，将丙烯酸类单体接枝到 明胶分子上，就可在正常体温条件下长时间保持明胶的凝胶形态。屮基

2、丙烯酸（methylacrylic acid, MA）改性后的明胶在紫外光和光引发剂共同作用下可生成水凝胶， 是软骨组织工程研究中使用的一种支架材料， 这种可注射光引发 聚合水凝胶材料能够自我塑形，用于填充形状和尺寸各异的组织缺损，造成的 创伤小，能使得细胞均匀分布在支架材料内部呈三维立体生长，提供仿生的环 境，水凝胶含有大量的水分可支持营养物质和细胞代谢产物的交换。因此本研 究以人牙髓细胞（human dental pulp cell, hDPC）为对象，研究光引发聚合 屮基丙烯酸改性明胶（gelatin methacrylate, GM）水凝胶是否有作为牙髓再 生支架材料的潜能。1.1.材

3、料和方法1. 1 材料A 型明胶（acid-processed gelatin, G）、94%MA 艳固佳 2959 型光引发剂（Sigma 公司，美国），透析袋（Biosheirp 公司，美国），a 型改良伊格尔 培养基（modi-fied eagle* s medium of alpha type, u-MEM）、改良杜氏伊格 尔培养基（dulbecco, smodified eagle medium, DMEM） （Hyclon 公司，美 国） ，胎牛血清（fatal bovine serum,FBS） （Hyclon 公司，美国）；磷酸 盐缓冲液（phosphate buffersol

4、ution, PBS）（武汉博士德生物工程有限公 ,青霉素-链霉素、I 型胶原酶、分散酶、0.25%胰酶（Gibco 公司，美 :细胞 i|数试剂盒（cell counting kit, CCK） -8 （Kumamoto 公司，日 ；台盼蓝染液（Sigma 公司，美国）:平底六孔培养板（Mme 公司，美 。紫外光交联仪（Hoefer 公司，美国）；冷冻干燥机（北京博仪康公 :ACE200型 200MHz 高分辨率超导核磁共振（nucleeir magneticresonance NMR）仪（Bruker 公司；德国）；扫描电子显微镜（scan-ning electron microscope

5、, SEM） （FEI 公司，荷兰）；旋转流变仪（Haake 公司，德国）；倒置相差显微镜（Nikon 公司，日本）：倒置荧光显微 镜及照相系（Olympus 公司，日本）。1.2 方法serum.司）国）本）国）司）1. 2. 1 合成 GM 将 Ig G 与 10 mL PBS 溶液混合，在 5(rC 恒温条件下搅拌20 min 以上直至明胶完全溶解，再缓缓加入浓度为 94%的 MA 1 mL,继续在 5(rC条 件下搅拌， 反应持续 1 ho 随后加入 l(rC 的 PBS 溶液 40 mL,充分混合后置于 截留相对分子量为(8-14) X103 的透析袋中，在 4(rC 条件下用双蒸水

6、透析 1 周。透析后的溶液用液氮迅速冷冻后，真空冷冻干燥机冻干处理 1 周，密封保 存于-82C 1.2.2 分析 GM 1) NMR：取 0.5 mg GM、G 和 MA 分别溶于 D.O,用高分辨率 超导 XMR 检测三者的结构构象，并对比。2) SEM：分别扫描 GM 的断面和表面， 观察其表面形貌。1. 2. 3 制备 GM 水凝胶用 6(rC 的 PBS 将 GM 配成质量分数 10%的溶液，0. 02urn 滤器过滤除菌后， 转入超净台内操作。 取 10 mL 该溶液， 加入 50 mg 光引发 剂充分混匀，配成 GM 水凝胶准备液。取 1 mL GM 水凝胶准备液置于六孔板中，

7、放入紫外交联仪，选择光强 8 mW cm-2、365 nm 条件下辐照 10 min, GM 准备 液聚合成 GMTk 凝胶。1. 2.4 GM水凝胶的力学性能质量分数10%的GM准备液制备成的直径约50 nm,片度大于 1 mm 的 GM 水凝胶设为实验组，质量分数 10%G 溶液制备成的 G 凝 胶设为对照组，规格同上。选用 37C 恒温-频率扫描模式，用流变仪检测 2 组 的黏弹性，间接反映 2 种材料的力学性能。1. 2. 5 培养 hDPC 取临床 18-25 岁患者因阻生需要拔除的健康完整的牙齿(四川大学华西口腔医院医学伦理委员会批准且患者知悄同意)，参照 Gronthos采用的取

8、材方法，在无菌条件下劈开牙齿，取出牙慵组织，切除根尖 1/3 部分，PBS 反复冲洗：将牙髓组织剪碎成小于 1 mmxlmmxlmm 的组织块，含 3 g L-1的 I 型胶原酶和 4 g L-1 的分散酶溶液于 37C 水浴锅中消化组织块 30 min,离心 5 min、弃上清，含 20%FBS 的 u-MEM 培养液调整细胞密度，混匀 后接种于 25 cm22 培养瓶中，37C、5%C02 温箱中培养 2 d,半量换液，然后每 3 d更换培养基 1 次。待细胞生长融合达 80%时，0. 25 g L-1 胰酶消化传代， 按1X105 个-mL-l 细胞数接种传代后培养。1.2.6 GM 水

9、凝胶的细胞毒性和生物相容性 1)直接法：取第三代 hDPC,用 无菌的 GM 水凝胶准备液制备成细胞浓度为 1X106 个，mL-I 的细胞悬液，在紫 外光聚合反应中形成细胞 GM 水凝胶，随后转移至已添加培养基的六孔板中，常 规培养 3 d 之后，在光镜下观察细胞生长状况。2)间接法：以 GM 水凝胶： DMEM 培养基=0.2 g： 1 mL 的比例，密封后置于细胞培养孵箱中 3 d,提取 GM 水凝胶浸提液作为 A 组：用同样的方法处理 DMEM 培养基作为 B 组。A、B 两组 液体分别加入10%FBS, 1%双抗，培养 hDPSCo 3 d 后小心弃去孔板中的培养 基，PBS 清洗后

10、加入数滴 0.4%台盼蓝溶液，室温下染色，5 min 后吸出染液， PBs 清洗残留染液，光镜下观察蓝染细胞，评佔 GM 水凝胶的细胞毒性。CCK-8 法测 A 组和 B 组培养 7min、d 的细胞增殖曲线，从而评估 GM 水凝胶对细胞增殖的影 响。2.2.结果2. 1 GM 的制备与表征MA 改性明胶在光引发剂引发下， 经紫外光辐照后形成水凝胶。 GM 冻干后肉 眼可见呈疏松多孔结构，易溶于水，SEM 扫描断面可见大小均一数量颇多的孔 隙结构（图 1 左），孔径大约 10 um,而表面的图像也能看到致密多孔 （图 1 右） ，孔径 15-25 um,这种结构在形成水凝胶仍然会保持，孔隙会增

11、大，有利 于细胞的黏附长入，并且可保留大量水份支持细胞的营养代谢。从 NMR 图像 （图 2）上来看，可以看到 GM 结合了 MA 的甲基，在（5-6） X10-6 处形成了 代表特征性的 MA 酰胺结构的峰，而改性前后明胶特异性的谱图基本保持一致， 说明改性对明胶的整体分子结构没有重大影响。2. 2GM 水凝胶的力学性能在使用流变仪测量过程中， GM 水凝胶的形态没有出现明显变化， 而 G 凝胶 在37C 恒温测量台上已经变成溶胶状态。 测量结果如图 3 所示， 在 0. Ol-lOOHz 的频率扫描模式下，GM 水凝胶储存模量接近于明胶的 10000 倍，说明 GM 水凝 胶具有弹性，在一

12、定的范围内，随着频率的增加，GM 水凝胶的弹性模量和损耗 模量儿乎保持不变。而 G 凝胶则明显不同，弹性模量与损耗模量则随着频率的 增加而大幅度增加。说明在经过屮基丙烯酸改性之后，减少了明胶分子链之间 的滑动，弹性模量和损耗模量受频率的影响大大降低（图 3） O2. 3GM 水凝胶的细胞毒性和生物相容性用 CCK-8 测量 7 d 的增殖曲线（图 4）,可见 GM 浸提液培养的细胞增殖速 度略低于 DMEM 培养基，但基本保持逐渐递增的趋势，说明 GM 水凝胶对 hDPC 无 明显毒性抑制作用，在一定程度上能维持细胞的生长。将牙髓细胞-GM 准备液悬液经紫外光引发聚合形成细胞 GM 水凝胶，培养 2 d后观察到细胞能在凝胶中维持基本形态。用 GM 水凝胶浸提液培养细胞，与普 通DMEM 培养基对照，2d 后用台盼蓝染色，死细胞被染成蓝色，镜下可见少有 细胞蓝染，其余细胞形态&好（图 5） O3 3讨论牙组织工程是时下研究热点之一，组织工程牙髓再生能够规避传统根管治疗的弊端，恢复牙髓的支持营养功能，避免牙髓丧失造成的牙体变脆崩裂。以 往研