结肠癌细胞株、癌组织及正常结肠粘膜中P16基因异常甲基化率的

1、    结肠癌细胞株、癌组织及正常结肠粘膜中 P16基因异常甲基化率的差异        摘要本文采用Southern blot法鉴定了结肠癌细胞株、癌组织及正常结肠粘膜组织中P16基因的甲基化情况。结果在6株结肠癌细胞株中有5株(83.3%)P16基因CpG岛呈异常甲基化状态，在18例结肠癌组织中13例(72.2%)呈异常甲基化状态。与之相对，18例正常结肠粘膜组织中仅5例(27.8%)表现为异常甲基化，提示在结肠癌中P16基因因异常甲基化而失活，这为结肠癌的基因

2、治疗提供了新策略、新目标。关键词结肠癌；P16基因；甲基化；基因治疗 The Difference of P16 Gene's Aberrant Methylation RateBetween Colon Cancer and Normal Colonic MucosaXie Yuanfeng，Wu Jinsheng,Yao Xiu,et alThe General Surgery Department of Tang Du Hospital of theFourth Military Midical University,Xi'an 710038The methylation

3、 rate of P16 gene in colon cancer cell lines,colonic cancer tissue and normal colonic mucosa were examined by Southern blot method.The data showed that aberrant methylation of 5'CpG island of P16 gene was observed in 5 of 6(83.3%) colon cancer cell lines,13 of 18(72.2%) colon cancer tissue.In co

4、ntrast,only 5 of 18(27.8%) normal colonic mucosa showed aberrant methylation of the 5'CpG island of P16gene.The results suggest that P16gene in colon cancer was inactivated by aberrant methylation.This can provide a new tactics and a new target for colon's gene therapy.Key words：colon cancer

5、;P16 gene;methylation;gene therapyP16基因为新发现的抑癌基因，在多种肿瘤中都检测到同源性缺失或杂合子丢失，但结肠癌却几乎是唯一的例外1，无论用何种方法都未发现结肠癌中P16基因有上述失活方式。James等人报道在结肠癌细胞中发现P16基因呈异常甲基化状态，并认为此发现意义重大2，但Mirella等人认为正常结肠粘膜中也存在P16基因甲基化3。故对甲基化在结肠癌的意义目前仍存在争议。国内尚无此方面的报道。本文即通过Southern blot法鉴定结肠癌细胞株、癌组织及正常结肠粘膜组织之间甲基化率的差异，以确定结肠癌中P16基因是否以甲基化方式失活，以指导临床基

6、因治疗结肠癌。1材料和方法1.1材料1.1.1细胞培养本实验共培养结肠癌细胞六株，分别是SW480、Colon205、HR8348、HT29、Colo320、LSIGT9695。同时培养一株胆管癌细胞QBC939作为阴性对照。其中SW480由我校口腔中心实验室惠赠。Colo205由我校免疫教研室惠赠。HR8348由本科实验室提供。其余四株细胞均购自北京301医院。1.1.2结肠组织标本收集从本院普外科收集经质控合格的新鲜结肠癌标本18例，每例均在无菌条件下同时取癌组织及手术切缘处正常结肠粘膜组织各一块。1.1.3主要试剂限制性内切酶Hind及Sac购自西安华美公司，地高辛标记的P16基因探针购

7、自北京中山生物技术有限公司。1.2方法1.2.1基因组DNA提取及纯化细胞及组织基因组DNA提取及纯化按分子克隆实验指南进行4。用紫外分光光度计检测使其纯度达到2>0D260/0D280>1.8，使其浓度在0.40.6ug/ul左右。1.2.2基因组DNA的限制性酶切每份DNA取5ug(约10ul)，加入1u/ul的Hind1ul,2u/ul的Sac 1ul,buffer C 2ul,蒸馏水6ul组成30ul的酶切体系，置于37°C水浴6小时。1%琼脂糖凝胶电泳观察。1.2.3Southern blot电泳结束后，将琼脂糖凝胶进行碱变性及中和处理，再将胶上DNA用毛细管法

8、转印在硝酸纤维素膜上。将地高辛标记好的基因探针与滤膜杂交，然后进行显色反应。方法依照分子生物学常用方法进行5。2结果2.1结果判定标准由1知，当仅Hind发挥了酶切作用时，可得到一条6kb长的片段；若Hind及Sac均发挥了作用时则可得到一条3.9kb长的片段。所以，当杂交出的亮带位于6kb处说明P1616基因CpG岛未甲基化。1本来源于参考文献21 P16基因酶谱。其中PE1为Southern杂交所用探针，第二行中的长方块为外显子13，可见其上有甲基敏感酶Sac(Sa)的酶切位点及对甲基化不敏感的Hind(H3)的酶切位点。基因下附为CpG及GpC岛上二核苷酸的密度。最下边的为酶切后片段长度

9、。2.2杂交及显色结果28为转印后杂交结果。每一幅的1处的亮带为阴性对照，为胆管癌细胞QBC939 DNA杂交后结果；4处的空白为电泳时分子量标准物杂交结果，本文所用为-噬菌体Hind酶解片断。其余各处为样品DNA杂交结果。2中样品所加顺序依次为Colo205、HT29、SW480、HR8348、Colo320、LSIGT9695。35中样品所加顺序依次为第1至第18份癌组织，68中样品所加顺序依次为第一至第十八份正常结肠粘膜组织。2.3结果统计表1结肠癌细胞株、癌组织及正常结肠粘膜中P16基因的甲基化情况项目甲基化未甲基化甲基化率癌细胞株5183.3%癌组织13572.2%正常粘膜51327

10、.8%2检验癌细胞株与癌组织之间P>0.05，相差不显著；癌细胞株与正常结肠粘膜组织之间P<0.05，相差显著；癌组织与正常结肠粘膜组织之间P<0.05，相差显著3讨论Southern blot法为研究DNA分子特点的经典方法，灵敏度和可信度都较高。本实验采用此法在国内首次鉴定了结肠癌细胞、癌组织及正常结肠粘膜组织之间甲基化率的差异情况。结果表明前两者与后者之间P16基因的甲基化率存在显著差异，这提示在结肠癌中P16基因因甲基化而失活，此结果证实了James等人论断正确。结肠癌为常见的恶性肿瘤，从理论上讲P16基因作为细胞周期直接抑制因子，在结肠癌中亦应有较高的突变率。令人不

11、解的是经免疫组化和Southern blot法反复检测，目前国内外尚未发现结肠癌中存在常见的纯合性缺失或杂合子丢失等失活方式。DNA甲基化为一少见的DNA失活方式，甲基化一般发生在DNA5起始区或调节区CpG岛上6。抑癌基因甲基化后，不能正常转录、翻译出抑癌蛋白，无法发挥抑癌作用，细胞就可能发生癌变。在结肠癌中甲基化失活方式的发现对结肠癌的临床诊治意义重大。(1)P16基因甲基化与结肠癌的诊断P16基因甲基化失活方式与其它突变方式一样，在结肠癌的发生中起关键性的闸门作用7。与P53基因突变属晚期分子事件不同，P16基因甲基化失活属早期生化事件。P16基因甲基化的发现为结肠癌的早期诊断提供了一条

12、新途径。临床上可以采用灵敏、无创的方法检测患者P16基因甲基化情况，如检测患者粪便中的P16基因的甲基化率，可普查及诊断早期结肠癌，其准确性及早期性将优于以往的任何方法。(2)P16基因甲基化与结肠癌的治疗目前将P16基因转入癌细胞中已有达到逆转异质性目的的报道。Arap8等人将全长P16基因转入人神经母细胞瘤中，观察到明显细胞生长受抑。目前尚无将P16基因转入结肠癌中有阳性结果的报道。P16基因甲基化的发现，提示如果向结肠癌中转入P16基因，脱甲基剂的应用应引起重视。由于体内存在甲基化环境，只单纯地转入P16基因，可能短期内有效，但很快会被甲基化而达不到长期逆转异质性的目的，如果联合应用脱甲

13、基剂，就有可能达到预期目的。人体是复杂的平衡系统，仅这些结果尚不能解决实际问题，但它为结肠癌的基因治疗提供了新策略和新目标。以后可以用更灵敏、更准确的方法来获得更详实的资料，如体内的甲基化环境其始动因素及还原因素都是什么?结肠癌中的P16基因为什么选择此种甲基化失活方式?其它抑癌基因有无这种失活方式?各期结肠癌及各种结肠病中P16基因的甲基化率有无差异?等等，这些都需要科研工作者作进一步的深入研究。(本文见封2)作者单位：710038西安，第四军医大学唐都医院普外科 参考文献1Kamb A,Gruis NA,Weaver FJ,et al.A cell regulator potentiall

14、y involved in genesis of many tumor types.Science,1994,264:4364402James G,Herman,Adrian M,et al.Inactivity of the CDKN2/P16/MTS1 gene is frequently associated with aberrant methylationin all common human cancer.Cancer Res,1995,55:452545303Mirella GZ,Chrislina M,Bender,et al.Methylation of the 5'CpG island of the p16 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing.Cancer Res,1995,55:453145354萨姆布鲁克等著，金冬雁等译.分子克隆实验指南.第2版.北京：19925姜泊等主编.分子生物学常用实验方法.人民军医出版社，1996，70806Jones PA and Taylor SM.Cellular differentiation,