香蕉园土壤16SrDNA文库分析

1、基金项目：海南大学2009年科研项目（No. hd09xm65）；农业部公益性行业专项（No. 200803031）资助。第31卷第6期热带作物学报Vol31No62010年6月CHIN ESE JOURNAL OF TROPICAL CR OPS Jun. 2010香蕉园土壤16S rDNA 文库分析黄珍1，谭志琼，阮云泽海南大学环境与植物保护学院，海南儋州海南大学农学院，海南儋州摘要以采自海南省福山香蕉园香蕉枯萎病发生地和正常种植园的土壤样品为试验材料，对这两类土壤的细菌多样性进行研究。通过构建2种土样的细菌16S rDNA 基因文库，利用限制性内切酶HhaI 对随机克隆进行酶切筛选，测定

2、代表克隆的16S rDNA 序列，并对2种土样的细菌种群进行了系统发育分析比较。结果表明正常香蕉种植区的土壤样品的细菌多样性较为丰富，其中变形菌门、厚壁菌门、酸杆菌门为主要细菌类群；而香蕉枯萎病发生地土壤以放线菌门和厚壁菌门为主要细菌类群。关键词香蕉园；土壤细菌多样性；16S rDNA 基因文库中图分类号S154.381香蕉是世界四大热带水果之一，也是我国出口创汇的重要资源，更是海南省高效农业的支柱产业。但是随着香蕉产业的飞速发展，香蕉病害也正在逐步蔓延，尤其是香蕉枯萎病，它给中国乃至世界香蕉产业带来了毁灭性的危害。目前，中国防治香蕉枯萎病的方法主要有：抗性品种利用、化学防治、土壤熏蒸或施用石

3、灰粉等农业措施及生物防治。现用方法在一定程度上延缓了香蕉枯萎病的蔓延，但对病害发生地区土壤却束手无策1-4。研究表明，土壤的理化性质及微生态特性对土壤中的镰刀菌都有较大的影响5。随着研究技术的发展，基因文库技术逐渐成为研究土壤微生物的重要工具。利用基因文库技术能较好地呈现自然生存状态下各种微生物的活性，并能发现大量未培养微生物，显著地提高了微生物资源的开发和利用，这无疑为解决香蕉枯萎病这类土传病害提供了新思路。本试验通过构建16S rDNA 文库，对比多年种植香蕉但未发生枯萎病的土壤和香蕉枯萎病发病蕉园土壤的细菌种群特征，以期从微生物多样性的角度分析香蕉枯萎病发病土壤与正常香蕉种植区土壤之间的

4、区别。1土壤样品采集自海南省福山地区普通香蕉园。该地区土壤属于砖红壤，原始土壤基本理化性质为：pH 值为5.15，有机质含量2.2，全氮126.67mg/kg，速效磷37.99mg/kg，速效钾122mg/kg。采用五点混合法，采集深度为515cm 。第1份样取自发生枯萎病地块的枯萎病香蕉根际，（土样编号为D1），第2个样取自有6a 种植香蕉历史但无香蕉枯萎病发生的土壤（土样编号为D2）。两块取样地相距100m 。EDTA （乙二胺四乙酸）、CTAB （十六烷基三甲基溴化铵）、异硫氰酸胍购于Amresco 公司，凝胶回收试热带作物学报31卷剂盒购于Biomiga 公司，Hha 限制性内切酶购于

5、Fermentas 公司。pMD-18T 载体购于Takara 公司。方法土壤DNA 的提取和纯化土壤微生物基因组的提取参照文献报道的差速离心法间接提取土壤总DNA 6。Takara 公司的DNA 纯化试剂盒对粗提取的DNA 进行纯化。土壤样品总DNA 的16S rDNA 扩增以细菌通用引物27F （5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R （5-TACCTTGTTACGACTT-3）扩增土壤细菌16S rDNA 7。PCR 扩增体系：模板（土壤总DNA ）10ng ，上下游引物各（10pmol/L）1L ，2PCR Mixture 12.5L ，无菌水加至总体积为25L

6、 。PCR 扩增程序：94预变性5min ；94变性1min ，55退火1min ，72延伸1.5min ，15个循环；72延伸10min 。用10份提取DNA 样品，分别进行PCR 反应，每次反应设置三组重复，PCR 扩增产物用1琼脂糖凝胶电泳检测并回收，将回收到的PCR 反应产物混合，以消除单次扩增的偏向性，通过这种方法增加土壤细菌16S rRNA 基因克隆文库构建的代表性，进一步减少PCR 过程中可能存在的误差。构建6S rDNA 文库及阳性克隆子的筛选PCR 回收产物与pMD-18T 载体连接，用热激的方法转入大肠杆菌DH5，在含有Amp 、x-gal 和IPTG 的LB 平板上培养1

7、216h ，随机挑取白色克隆子，保存并构建文库。以载体引物M13-47（5-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC -3）和RV -M （5-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3）8扩增克隆子来检测是否为阳性克隆，PCR 扩增体系：模板为阳性克隆子菌落，上下游引物（10pmol/L）各1L ，2PCR Mixture 12.5L ，无菌水加至总体积为25L 。PCR 扩增程序：94预变性5min ；94变性1min ，48退火1min ，72延伸1.5min ，35个循环，72延伸10min 。阳性克隆子扩增产物检测回收后进行Hha I 酶切9，细菌的16S rDNA

8、阳性克隆子表现出丰富的多态性，通过对酶切条带的分析，选择克隆子送交南方基因公司进行测序。16S rDNA 文库的测序结果和系统发育分析采用Blast 程序将测得序列与NCBI 数据库中的序列进行相似性比对，利用MAGA3.1和Bioedit 构建系统发育树。2结果与分析2.1土壤微生物DNA 的提取本试验采用间接法提取的土壤总DNA 片段大约在23kb ，提取的DNA 片段较为完整，纯度较高。通过紫外分光光度计定量土壤微生物总DNA ，DNA 提取量约为0.96g/g干土，吸光度值A 260/A280约为1.7。22土壤细菌16S rDNA 基因克隆文库的构建利用细菌通用引物进行土壤细菌16S

9、 rDNA 扩增，可以得到1500bp 大小的条带见图1和图2，说明提取的土壤总DNA 可直接用于PCR 反应。将16S rDNA 片段插入到克隆子中，每个处理随机挑选阳性克隆子进行菌落PCR ，纯化后采用Hha 限制性内切酶消化，获得一系列的酶切图谱，其部分酶切结果见图3和图4。根据酶切条带位置及数量的不同，分为不同的酶切类型，并计算库容。库容（coverage C ）计算公式为：C =1-N ， 图1990期N 代表文库中总克隆数，nl 代表在文库中仅出现一次的OTUs （OPerational Taxonomic Unit ）的数量。理论上表示文库中所含的微生物种类占土样中全部微生物种类

10、的比例，文库中各种微生物类群比例可以反映在土壤原始状态下微生物的多样性8，所检测的酶切条带类型的数目多，库容大，所反映的微生物多样性越真实可靠。正常香蕉园土壤酶切类型较多，共47种，出现一次的酶切类型即单一克隆有13个占6.5，该文库的库容为93.5，香蕉枯萎病病害土壤的酶切类型较少，共21种，单一克隆为4个，所占比例为4，库容为96。通过对16S rDNA 基因克隆文库的酶切分析，得到土壤细菌群落多样性的初步信息，从本试验看来两个文库的库容值较高，说明本试验所得数据能比较完整的反映该地区土壤微生物群落组成。比较两个文库的差异发现，文库D2酶切条带多，库容相对较小；文库D2的酶切条带种类及丰度

11、大于文库D1，正常香蕉园土壤的微生物种类多于香蕉枯萎病病害土壤微生物种类。2.3土壤16S rDNA 基因克隆文库系统发育分析通过RFLP 分析，按照2个基因文库中的酶切图谱，将克隆子分为若干个可操作单位（OTUs ）。土样D1可以分为3个OTUs ，土样D2可以分为5个OTUs 。每个OTUs 随机挑选阳性克隆子进行测序，测序结果通过GenBank 数据库进行比对分析，结果发现大多数的克隆序列与数据库中已提交的序列相似性介于8999。将测序序列与不同类群的细菌进行比较，土样D1的克隆子29属于厚壁菌门，22属于放线菌门，还有少部分属于变形菌门、硝化螺旋菌门、酸杆菌门，但还有少部分克隆子没有在

12、Blast 中发现较高同源性的序列。土样D2的克隆子中变形菌门占42，厚壁菌门占26，酸杆菌门占6, 还有少部分放线菌门和蓝藻门，大多数属于未可培养微生物。根据克隆子在Blast 比对结果，构建系统发育树（见图5），明确这些文库中克隆子的系统发育地位。通过系统进化树可以看出，土样D1和土样D2均具有较高的多样性，土样D2的细菌种类更丰富，可见土壤环境的变更对土壤中细菌的种类有极大的影响。在土样D1中，存在的细菌多为放线菌门和厚壁菌门，而在正常土壤中还存在变形菌门和酸杆菌门等优势菌，发生香蕉枯萎病的土壤中大多数普通土著菌的分布有明显的影响，而放线菌门和厚壁菌门的少量种属细菌可以在其中继续生长繁殖

13、。黄珍等：香蕉园土壤16S rDNA 文库分析A ：D1土样的系统发育树 图4 图 酶切图991热带作物学报31卷 3讨论香蕉枯萎病属于土传病害，一旦一个地块发病，病菌蔓延快，很难根治。现今认为使用生防菌从微生态角度控制香蕉枯萎病是最为安全有效的方法10。本文通过对正常香蕉园土壤和香蕉枯萎病病害园土壤的16S rDNA 文库构建和比较，利用分子生物学技术对两种土壤的细菌多样性的构成进行分析，从而为香蕉枯萎病的控制提供依据。由于本文实验方法应用的是分子生物学的方法（如DNA 提取，PCR 扩增等），这些步骤都有可能使结果产生偏差，所以需谨慎处理，以减少偏差，使文库构成可以在最大程度上代表土壤样品

14、中细菌组成的真实结构。首先环境土壤总DNA 的提取和纯化是后续分析的基础和关键，只有获得完整且高质量的土壤样品总DNA 才能保证分析结果的准确、可靠。本试验采用间接法提取土壤总DNA ，由于每次提取所用的土壤量较多，保证了所提取的DNA 中所含的信息量丰富，同时DNA 条带完整说明所含的信息完整，有利于后期分子生物学反应。其次在PCR 过程中，采用减少循环次数，并将多份DNA 样品重复进行PCR 后，多次PCR 产物混合后构建文库，从而达到减少PCR 过程中可能优先扩增GC 含量低的模板，在退火时引物因为对有些模板序列的偏爱而优先扩增等造成的偏差。本文应用16S rDNA 克隆文库技术，研究比

15、较了香蕉林正常土壤和香蕉枯萎病侵害土壤的细菌群落的多样性，较好的呈现出自然状态下由香蕉枯萎病病菌侵害导致土壤环境变更的土壤细菌群落组成的差异。从两个文库比较分析，正常香蕉地土壤中细菌多样性较好，相比较香蕉枯萎病发生地细菌种属较少，但B ：土样D2的系统发育树图5基于16S rDNA 序列的香蕉枯萎病病害土壤细菌系统发育树992期放线菌门在土壤中的比例增加，变形菌门存在比例减少，表明放线菌门比变形菌门容易在香蕉枯萎病发生地土壤中生存。通过对比两个文库的种群组成不同，为生防菌引入该土壤生态环境中时必须考虑到对生防菌的萌发和定殖的影响提供了可靠依据。通过16S rDNA 克隆文库技术的应用，有助于发

16、现大量在实验室不可培养但在土壤环境中具有重要作用的微生物11。因此构建香蕉枯萎病侵害的土壤16S rDNA 文库，可以作为直接从病害土壤中寻找未培养微生物资源和研究该环境中土壤微生态的基础。参考文献1张志红，李华兴，韦翔华，等生物肥料对香蕉枯萎病及土壤微生物的影响J生态环境，2008，17（6）：2421-24252王芳，李静，陈云香蕉枯萎病拮抗菌的筛选及抑茵作用研究J河南农业科学，2009（8）：98-1003杨秀娟，杜宜新，甘林，等香蕉枯萎病生物防治和抗病育种研究进展术J中国果树，2008（6）：42-454钟群有，郑卓辉，彭增明，等香蕉枯萎病生物防治研究概述J广东农业科学，2007（7）

17、：64-655黎永坚，于莉香蕉枯萎病发病机制及其防治技术研究J中国农学通报2006，22（8）：515-5196Changhyun Roh ，Francois Villattebyung-gee Kim ，Rolf D Schmid Comparative Study of Methods for Extraction and Purification of Environmental DNA From Soil and Sludge SamplesJApplied Biochemistry and Biotechnology ，2006（134）：97-1127张建萍，董乃源，余浩滨，等应用

18、16S rDNA-RFLP 方法分析宁夏地区稻田土壤细菌的多样性J生物多样性，2008，16（6）：586-5928滕齐辉，曹慧，崔中利太湖地区典型菜地土壤微生物16S rDNA 的PCR-RFLP 分析J生物多样，2006，14（4）：345-3519朱国锋，吴兰，李思光RFLP 技术在湖泊微生物多样性研究中的应用J环境科学与技术，2008，11（31）：9-1210张志红，李华兴，韦翔华，等生物肥料对香蕉枯萎病及土壤微生物的影响J生态环境，2008，17（6）：2421-2425. 11燕艳，陈键，燕昌江，等利用分子生物学技术鉴定土壤微生物的方法J东北农业大学学报，2008，39（3）：1

19、29-133Phylogenetic Diversity of Bacteria in Banana Soils Determinedwith 16S rDNA Library AnalysisHuang zhen 1，Tan zhiqiong 1，Ruan Yunze 21College of Environment and Plant Protection ，Haina University ，Danzhou ，Hainan 571737, China ；2College of Agronomy ，Haina University ，Danzhou ，Hainan 571737, ChinaAbstract Soil samples were collected from banana wilt occurred and normal-growing areas from Fushan, Hainan to study the microbial community diversity .After constructing the 16S rR