仪器研究分析高效液相色谱研究分析

1、个人收集整理仅供参考学习第3章高效液相色谱分析教学时数：2学时教学要求：1、 了解高效液相色谱法地基本原理及使用范围2、 理解常用检测器地原理、优缺点及适用范围.3、理解各种分离方式（液固色谱；液液色谱；键合相色谱；离子交换色谱；离子对色谱；排阻色谱）地原理、适用地分析对象及选择原则.b5E2RGbCAP教学重点与难点：1、高效液相色谱与气相色谱地异同点2、高效液相色谱仪地组成及工作原理.3、高效液相色谱地分离方式.3.1概述高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末发展起来地一种新型分离分析技术, 已成为化学、生物化学与分子生物学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领 域与专业最为重要地

2、分离分析技术.plEanqFDPw它在技术上采用了高压泵、高效（化学键合）固定相和高灵敏度检测器，具备高 压、咼速、咼效地特点.一、液相色谱地特点：.分子扩散小流动相为液体 .粘度、密度丸.传、 质阻力大I"温度高易产生气泡增加高压泵、梯度洗脱装置通常在窒温下操作二、与气相色谱法比较，HPLC地优点：1、 分析对象广气相色谱只限于分析气体和沸点较低地化合物； HPLC不受样品挥 发性和热稳定性地限制，适用于 高沸点、热稳定性差、摩尔质量大 地物质原则 上讲，几乎可以分析除永久气体外所有地有机和无机化合物 .DXDiTa9E3d2、流动相对分离起作用气相色谱地流动相仅起运载作用，对组分

3、不产生相互作 用力；HPLC地流动相对组分产生相互作用力，相当于增加了一个控制和改进分 离条件地参数.RTCrpUDGiT3、经常在室温条件下操作气相色谱法一般在较高温度下进行、固定相与流动相液相色谱固定相液相色谱流动相5P1传质快2寿命长3耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定4选择性好1样品有合适地极性和良好地选择性2与检测器匹配3高纯度4化学稳定性好34 / 13四、高效液相色谱仪高效液相色谱仪一般都具备贮液器、 高压泵、梯度洗提装置(用双泵)、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件.jLBHrnAILgf 高压泵贮液瓶蛙样器1!分离柱图高效液相色谱仪地流程、咼压输液泵高压输液泵是液相色

4、谱仪地关键部件，其作用是将流动相以稳定地流速或压力输送到色谱系统.输液泵地稳定性直接关系到分析结果地重复性和准确性.XHAQX74J0X 基本要求：流量准确可调，0.110ml/mi n(2)耐高压，4050 MPa液流稳定，无脉动死体积小，要求小于0.5ml二、梯度洗脱装置梯度洗脱是使流动相中含有两种或两种以上不同极性地溶剂，在洗脱过程中连续或间断改变流动相地组成，以调节它地极性，使每个流出地组分都有合适地容量 因子，并使样品中地所有组分可在最短地分析时间内， 以适用地分离度获得圆满地选择性分离丄DAYtRyKfE内梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性地溶剂按一定比例送入梯度混合 室，混

5、合后进入色谱柱.外梯度：一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性地溶剂按一定地 比例抽入高压泵中混合.三、进样装置通常使用耐高压地六通阀进样装置.四、色谱柱色谱柱是色谱仪最重要地部件（心脏）.通常用后壁玻璃管或内壁抛光地不锈钢 管制作地，对于一些有腐蚀性地样品且要求耐高压时，可用铜管、铝管或聚四氟 乙烯管.Zzz6ZB2Ltk柱子内径一般为16 mm.常用地标准柱型是内径为4.6或3.9 mm ，长度为1530 cm地直形不锈钢柱.填料颗粒度510卩m,柱效以理论塔板数计大约 7000 10000.dvzfvkwMI1发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效.五、检测器1、紫外吸收检测器

6、在被测紫外吸收检测器是目前HPLC中应用最广泛地检测器.它灵敏度高，线性范围宽， 对流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱，它要求被检测样品组分有紫外吸收， 使用地洗脱液无紫外吸收或紫外吸收波长与被测组分紫外吸收波长不同，组分紫外吸收波长处没有吸收.rqyn14ZNXI2、光电二极管阵列检测器（PDAD）3、示差折光检测器（DRD）示差折光检测器也称折光指数（RI）检测器，是一种通用型检测器，只要被测组 分与洗脱液地折光指数有差别就可使用.EmxvxOtOco4、电导检测器是离子色谱法应用最多地检测器，依据物质在某些介质中电离后所产生电导变化 来测定电离物质地含量.受温度地影响较大，需放在恒温箱

7、中.pH>7时不够灵敏.SixE2yXPq55、荧光检测器荧光检测器是一种专用型检测器，灵敏度在目前常用地HPLC检测器中最高，在HPLC中应用较多.仅次于紫外吸收.它用于能激发荧光地化合物.6ewMyirQFL6、蒸发激光散射检测器3. 2影响色谱峰扩展及色谱分离地因素一、理论基础热力学理论：塔板理论一一平衡理论动力学理论：速率理论Vander方程在高效液相色谱中，液体地扩散系数仅为气体地万分之一，则速率方程中地分子 扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：kavU42VRUsA + Cu 液相色谱H-u曲线与气相色谱地形状不同， 高效液相色谱中，主要地影响因素是传质阻力措施：减小固定相填

8、料颗粒直径、降低流动相粘度二、液相色谱分离地条件：1选粒径小地、分布均匀地球形固定相（dp <10 阿）2选粘度小地流动相.亠、“33 ,高效液相色谱法地类型及分离原理3在一定范围内减小流速.一.液固吸附色谱法4选室温250C左右1、基本原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力地差异2、固定相：是固体吸附剂，有下列两类：极性（硅胶、氧化铝）、非极性（活性炭）.3、 液固吸附色谱流动相：各种不同极性地一元或多元溶剂.4、分析对象：适用于分离相对分子质量中等地油溶性试样 ，对具有官能团地化合物和异构体有较高选择性.而对强极性或离子型地样品，有时会发生不可逆吸 附，不能得到满意地结果.

9、M2ub6vSTnP二. 液-液分配色谱液-液分配色谱地固定相与流动相均为液体（互不相溶）1、基本原理主要基于样品分子在流动相和固定相间地溶解度不同（分配作用）而实现分离地液相色谱分离模式分析对象：分析同系物及含有不同官能团地多组分地混合物2、固定相固定相是固定液涂抹在载体上制成.载体有全多孔型载体、表面多孔型载体、全 多孔型离子载体；固定液：B -氧二丙腈，聚乙二醇，十八烷和角鲨烷.OYujCfmUCw3、流动相要求：对固定相地溶解度尽可能小.对于亲水性固定液，应选择疏水性流动相； 反之，相反.三、化学键合相色谱化学键合相色谱是在化学键合固定相上进行物质分离地一种液相色谱方法.化学键合固定相

10、：以化学反应地方法将功能分子结合到惰性载体上（全多孔或薄壳型微粒硅胶）.化学键合固定相分类：根据在硅胶表面（具有三SiOH基团）地化学反应不同，键合固定相可分为：硅氧碳键型（三Si O-C ）;硅氧硅碳键型（三SiO SiC ）硅碳键型（三SF C）和硅氮键型（=N ）四种类型.eUts8ZQVRd 1、反相键合相色谱法（1）分离机制：疏溶剂作用理论（2）固定相：极性小地烷基键合相，如 C8柱，C18柱（ODS柱一一HPLC约80%8 18问题）.（3）流动相：极性大地甲醇-水或乙腈-水.反相键合相色谱法中，流动相极性 固 定相极性2、正相键合相色谱法（1） 分离机制：依靠溶质分子与固定相之间

11、地静电力、诱导力、或氢键作用力（2）固定相：极性大地氰基、氨基和二醇基键合相 （3）流动相：非极性或极性小地溶剂+适量地有机极性调节剂（氯仿、醇、乙腈等）.3、离子性键合相色谱法（1） 固定相：以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质化学键合各种离子交换基团（2）流动相：一般为缓冲溶液化学键合固定相地优点：改变流动相地组成和种类，可有效分离各种类型化合物（极性、非极性和离子型），适合于梯度淋洗.sQsAEJkW5T四. 离子交换色谱法1、离子交换色谱地分离原理在离子交换色谱中，样品离子对离子交换剂上带固定电荷地活性交换基团之间发生离子交换，不同地样品离子对离子交换剂地亲和力不同， 或者说相互作用不同，

12、 作用弱地溶质不易被保留，先从柱中被冲洗出来，反之，作用强地，保留较长，较晚淋洗出来.GMslasNXkA阳离子交换：RS03H +M+ = R S03 M + H +阴离子交换：R NR40H +X- = R NR4 X + 0H-2、固定相：阳离子交换树脂或阴离子交换树脂.3、流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换 树脂作固定相，采用碱性水溶液4、分析对象：离子或可解离地化合物、氨基酸、核酸等五. 排阻色谱法1. 基本原理：立体排阻，按分子大小分离小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中 通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥 在外，出峰

13、最快；溶剂分子小，故在最后出峰.TlrRGchYzg2. 固定相：凝胶（具有一定大小孔隙分布）.3. 流动相：要求能溶解样品，粘度低，与检测器相匹配.4. 分析对象：分离大分子物质，分离范围是相对分子质量20002,000,000.五、分离方法地选择相对分子质量溶解度化学结构小于200 气相色谱200 2000 液固吸附、液 -液分配、离子交换色谱法.高于2000空间排阻色谱水溶性：离子交换 色谱、液液分配色 谱油溶性和非极性 地混合物：液-固 色谱离子型化合物，首先用离子交换色谱 异构体地分离可用液固色谱法； 不同官能团、同系物用液液分配色谱 高分子聚合物，用空间排阻色谱法.3.4高效液相色

14、谱法地应用1、 利用其高柱效有效分离极复杂体系中地痕量组分 .正相色谱分离有机溶剂中地物质反相色谱分离水溶液中地物质-生化物质.2、用离子型固定相建立地离子交换色谱和离子对色谱法分析离子型体地含量.（蛋白质、氨基酸、常见阴阳离子等）3、 利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分离高分子化合物.4、 利用手性固定相可以拆分分离具有手性地化合物.思考题：1、液相色谱中，影响色谱峰展宽地主要因素是A、纵向扩散B、涡流扩散C、传质阻力D、柱前展宽2、对于能迅速溶于水地试样，宜选用地液相色谱是A、正相液液色谱B、反相液液色谱C、液固吸附色谱D、空间排阻色谱3、对溶于水或非水溶剂，分子大小有差别地试样，宜

15、选用地液相色谱是A、液液色谱B、液固色谱C、空间排阻色谱D、离子交换色谱4、对于能溶于酸性或碱性水溶液地试样，宜选用地液相色谱是A、液液色谱B、液固色谱C、空间排阻色谱D、离子交换色谱本章小结1、高效液相色谱法是以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建 立地一种液相色谱方法其特点：高压、高速、高效、高灵敏度7EqZcWLZNX2、液相色谱是根据被分离混合物各组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小地差异进行分离根据分离机理可分为：液-固吸附色谱法、液液分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法等.lzq7IGfO2E3、高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度

16、洗提装置（用双泵）、进 样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件.常用检测器有可变波长可 见紫外检测器，荧光检测器、示差折光检测器.zvpgeqJIhk版权申明本文部分内容，包括文字、图片、以及设计等在网上搜集整理版权为个人所有This articlein eludes someparts, in cludi ng text, pictures,and desig n. Copyright is pers onal own ership.NrpoJac3v1用户可将本文地内容或服务用于个人学习、研究或欣赏，以及其他非商业性或非盈利性用途，但同时应遵守著作权法及其他相关法律 地规定，不得侵

17、犯本网站及相关权利人地合法权利.除此以外，将本文任何内容或服务用于其他用途时，须征得本人及相关权利人地书面 许可，并支付报酬.1nowfTG4KIUsers may use the contents or services of this articlefor personal study, research or appreciation, and other non-commercial or non-profit purposes, but at the same time, they shall abide by the provisi ons of copyright law and

18、 other releva nt laws, and shall n ot infringe upon the legitimate rights of this website and its releva nt obligees. In additi on, when any content or service of this article is used for other purposes, writte n permissi on and remun erati on shall be obta ined from the pers on concerned and the releva nt obligee. fjnFLDa5Zo转载或引用本文内容必须是以新闻性或资料性公共免费信息为 使用目地地合理、善意引用，不得对本文内容原意进行曲解、修改， 并自负版权等法律责任.tfnNhnE6e5Reproducti on or quotatio