人肝癌组织GGT基因甲基化状态与酶蛋白异常表达关系的研究

1、人肝癌组织GGT基因甲基化状态与酶蛋白异常表达关系的研究摘要目的 探讨肝癌发生过程中谷氨酰转肽酶(GGT)的表达及其改变机制。 方法 将肝癌、癌旁及远癌组织总GGT和RNA纯化, 观察总GGT、膜结合和可溶性GGT的表达,并以逆转录巢式PCR扩增GGT非编码区基因片段, 分析M3位点的甲基化状态。 结果 肝癌、癌旁和远癌组总RNA浓度呈明显的梯度升高趋势(P0.05)；癌组织总GGT、膜结合和可溶性GGT均高于癌周和远癌组织(P0.05)；在癌、癌旁和远癌组织中,特定基因片段的扩增检出率分别为100%，85%和75%, M3位点低甲基化频率分别为75%，55%和50%。 结论 肝癌组织中GGT

2、呈异常表达与基因低甲基化状态有关, 分析GGT基因可望成为监测肝细胞癌变的灵敏方法。关键词癌，肝细胞 甲基化 GGT基因 表达Relationship between methylation status of -glutamyl transpeptidase (GGT) genes and abnormal expression of its enzyme proteins in tissues of human hepatomasYAO Dengfu, TANG Qiyun, MENG Xianyong, et al. Affiliated Hospital, Nantong Medica

3、l College, Nantong 226001AbstractObjective To explore the mechanism of expression and alteration of -glutamyl transpeptidase (GGT) genes during the development of human hepatomas. Methods The total GGT protein and total RNA were purified in human hepatomas, adjacent paracancerous and distal cancerou

4、s tissues. The specific activities of total GGT, membrane-combine GGT and soluble GGT were investigated, the GGT gene of -NC region was amplified by using a nest RT-PCR assay, and methylation status of GGT gene M3 site were analyzed in the present study. Results An increasing tendency (P0.05) of tot

5、al RNA concentrations was found from cancer in distal cancerous tissues; the specific activities (U/g) of total GGT, membrane-combine GGT and soluble GGT were significantly higher (P3cm16例，50mg/L 12例，50mg/L 8例。病理学检查(HE染色)证实20例均为原发性肝癌(PHC)。癌旁组织中肝硬化15例，慢性肝炎3例，伴不典型增生15例；远癌组织中肝硬化11例，慢性肝炎8例,伴不典型增生9例；地衣红染

6、色显示HBV阳性17例。2. 酶蛋白和肝总RNA提取：湿重肝组织50mg两份，以pH8.6,0.1mol/L Tris-HCl匀浆液提取可溶性GGT；以含0.5%Triton X-100的匀浆液提取总GGT。置冰水浴中研碎后，于4过夜，经高速冷冻离心，上清液以g谷氨酰对硝基苯胺直接法，分析GGT活力(U/L)和酚试剂法测蛋白浓度(g/L)，计算总GGT、膜结合和可溶性GGT比活性(U/g)。另取组织50mg于无RNAase匀浆器中，以RNA制备试剂(Gibco，BRL)提取总RNA，在UV-2201型紫外分光光度计上测总RNA浓度(mg/g组织)，置于85保存。3.逆转录巢式PCR扩增：按肝癌

7、细胞株GGT核苷酸序列1，在基因-NC区设计引物(中国科学院上海细胞所合成)。取RNA以随机引物(Promega)和逆转录酶(Gibco，BRL)合成cDNA，进行巢式PCR扩增，每阶段35个循环。第一阶段PCR，以外部引物-CTCCATTCG TAGACCACCTC-(GT-1)和TAGGTTAGACTG TGGGCAGG-CTCCATTCG TAGACCACCTC-(GT-2)及cDNA为模板，产物为400bp，含有CCGG的M3位点(409bp处)；第二阶段PCR,以前产物为模板和内部引物-NC区设计引物(中国科学院上海细胞所合成)。取RNA以随机引物(Promega)和逆转录酶(Gib

8、co，BRL)合成cDNA，进行巢式PCR扩增，每阶段35个循环。第一阶段PCR，以外部引物-TGTCTGCCTCTGAGGTC AGA-(GT-3)和-CAGGTCTCTTGCTCACTG TA-(GT-4)进行扩增，终产物280bp。经2%琼脂糖胶电泳和紫外光照射，与标准DNA比较判别结果。4.甲基化状态分析方法：利用Hap能识别CCGG序列，并能在未甲基化的胞嘧啶(C)间切断该位点的限制性内切酶法，分析M3位点是否甲基化。取第一阶段PCR扩增产物5ml，加入Hap10U与双倍体积缓冲液于374小时，经2%琼脂糖凝胶电泳和紫外光照射，与标准DNA比较判别M3位点甲基化状态。若见与原设计一致

9、的322bp和78bp片段，则为该位点未甲基化；如见400bp系酶不能消化，则为此位点已甲基化；如无特异性片段出现，表示该法不能扩增此基因片段。5. 统计处理：用方差分析和检验，以s表示结果和进行两两比较。结 果1. 肝癌组织总RNA浓度与GGT表达：20例肝癌、癌周和远癌组织中总RNA浓度（湿重肝组织），分别为(21.826.8)mg/g，(40.930.5)mg/g，(54.945.7)mg/g，癌组织总RNA浓度明显低于癌周(P0.05)和远癌组织(P0.01)。不同组别总GGT、可溶性GGT和膜结合性GGT表达水平见表1,癌组织中总GGT和不同分子形式GGT的比活性,均明显地高于癌周或

10、远癌组织(P0.01)。表1 癌组织中GGT不同分子形式GGT的表达(s,U/g)组别份数总GGT可溶性GGT膜结合性GGT肝癌20101.9283.4549.7852.8451.0749.23癌周2050.6427.41*23.6515.62*28.4617.82*远癌2044.6517.82*21.7515.82*24.6413.28* 与肝癌组织比较: P0.05), 但各组内未甲基化例与甲基化例比较，均有显著性意义(P肝细胞结节性增生肝细胞小灶性增生正常肝组织，在癌变组织GGT表达接近胎肝的GGT水平，肝癌组织GGT基因所编译的肽链与胎肝GGT酶蛋白相一致，且组织GGT以可溶性GGT和

11、膜结合性GGT两种形式存在。结果发现在癌组织不同部分GGT的表达水平存在着明显差异，癌组织总GGT和不同分子形式GGT，均非常明显地高于癌周和远癌组织。且GGT的表达与总RNA浓度存在着不一致性，癌组织总RNA浓度明显低于癌周和远癌组织。人类GGT基因由-NC(744bp)区、可编码569个氨基酸的可读框架(1707bp)和含有AATAAA结构-NC组成。在GGT基因的-NC区含6个CCGG位点，有关位点的甲基化状态尚不清楚。文中将含M3位点酶切分析发现癌、癌周和远癌组织中，M3位点甲基化程度均低于30%，而存在着广泛的低甲基化其频度均在50%以上；各组内未甲基化例与甲基化例的差别非常显著，提

12、示GGT的表达受基因甲基化程度的调节。癌变过程中基因去甲基化，使已关闭的GGT基因重新活化，再过量表达的GGT引起肝组织和血中该酶活性的大幅度升高，另在癌的不同部分存在着甲基化状态的不均一性，使酶的表达也存在着差异3。近半数PHC患者血AFP浓度较低，显示GGT表达与AFP浓度无关。本研究成功地扩增了癌组织中GGT基因片段，扩增终产物280bp与原设计完全一致，区带清晰且特异。20例PHC组织100%阳性，在癌周和远癌组织中阳性率分别为85%和75%。可见对GGT基因的扩增分析法有着良好的应用前景4，可望成为在癌前期监测肝细胞癌变的灵敏且特异的诊断方法。基金项目:本研究受国家教委留学回国人员课

13、题资助(教外司留95-806)作者简介:姚登福男,41岁,副教授,科主任,博士。从事临床分子消化病学和肝癌早期诊断的研究,发表论文近百篇作者单位:姚登福汤琪云孟宪镛吴信华蒋道荣黄介飞江苏,南通医学院附属医院参考文献1Countay L, Heisterkamp N, Siest G, et al. Expression of multiple g-glutamyl transferase genes in man. Biochem J,1994, 297: 503-508.2Yao DF, Huang ZW, Chen SZ, et al. Diagnosis of hepatocellula

14、r carcinoma by quantitative detection of hepatoma-specific bands of serum g-glutamyl transferase. Am J Clin Pathol, 1998, 110: 743-749.3Baik JH, Griffiths S, Giuili G, et al. DNA methylation patterns of the rat gamma-glutamyl transpeptidase gene in embryonic adult and neoplastic liver. Carcinogenesis, 1991, 12:1035-1039.4Tsutsumi M, Sakamuro D, Takada A, et al. Detection of a unique gamma-glutamyl transpeptidase messeng