兔局灶性脑缺血微导丝法预处理模型的建立

1、兔局灶性脑缺血微导丝法预处理模型的建立         11-03-24 16:28:00     作者：刘蓉    编辑：studa20【摘要】  目的： 探讨稳定的兔局灶性脑缺血预处理微导丝法模型的建立及对其评价。方法： 健康新西兰白兔35只,随机分为3组:假手术组5只;缺血组10只，在DSA引导下，选择微导丝直接从颈总动脉(CCA)经颈内动脉(ICA)插至大脑中动脉(MCA)起始部4 h, 再灌注时,抽回导丝至颈总动脉内

2、；预处理组20只，在DSA引导下，选择微导丝从颈总动脉经颈内动脉插至MCA起始部停留15 min，再灌注时,抽回导丝至颈总动脉内停留15 min，如此重复3次，之后将微导丝堵于大脑中动脉起始部4 h,完成微导丝法局灶性脑缺血预处理模型的制作,并利用神经功能缺损评分、TTC和HE染色对模型进行评价。并且对模型行MRI常规扫描及弥散成像，分析MRI是否也能显示脑缺血预处理的存在。结果： 血管造影可清晰显示颈内动脉的走行及其颅内分支情况，8只（80，8/10）动物缺血模型成功，12只（60，12/20）动物脑缺血预处理模型成功。缺血/再灌注后3 h就可在T2WI，DWI表现为右侧海马及外侧基底节区高

3、信号，DWI范围大于T2WI，于24 h T2WI范围基本不变且T2WI与DWI范围相近。TTC染色将正常组织染成红色,梗死脑组织不染色而呈白色,不染色的范围与导丝栓塞后T2WI上的病变范围基本一致，预处理组最终T2WI上高信号区及TTC无染区体积均小于缺血组。结论： 采用微导丝直接从颈总动脉经颈内动脉插至MCA起始部, 栓塞15 min后，抽回导丝至颈总动脉内再灌注15 min，如此反复3次，能建立较稳定的脑缺血预处理模型。 【关键词】  缺血 预处理 磁共振 动物模型 兔    Abstract  Objective: To investi

4、gate reproducibility of intraluminal thread approach in making focal cerebral ischemia/reperfusion preconditioning model in rabbits. Methods： Thirtyfive  rabbits were randomly divided into three groups: Control group(n=5)was shamoperated. Ischemiac group(n=10), focal cerebral ischemia/reperfusi

5、on model was made under DSA by inserting a wire into MCA through ICA and CCA directly and pulling it out 4 hours later. The method of preconditioning group(n=20) was similar to that of ischemiac group, just pulling the  wire  out 15 minutes and pushing it in 15 minutes, 3 times repeatly,th

6、en pulling it out 4 hours later. Neurological deficit score,TTC and HE were used to evaluate the effectiveness of models.Whether could MRI  confirm the existence of preconditioning too？ Results： The course and bifurcation of ICA could be displayed clearly on the angiography. Eight in ten of isc

7、hemiac group  and twelve in twenty of preconditioning group(sixty percent) were successful models. High signal was seen on DWI and T2WI 3h after ischemia/reperfusion. White area of TTC matched the high sign area of T2WI,but the infarction  volume of preconditioning group  was less tha

8、n ischemiax group.  Conclusion： Focal Cerebral ischemia preconditioning model made by inserting a wire into MCA through ICA and CCA directly and pulling it out 15 minutes and pushing it in 15 minutes,3 times repeatly was stable and fit for imaging research.    Key words  isc

9、hemiac;  preconditioning;  MRI;  animal model; rabbit    众所周知，短暂性脑缺血发作（TIA）是发生缺血性卒中的危险因素之一。但近年来有文献指出，给予动物短暂性全脑或局灶缺血对间隔一定时间后的严重脑缺血有一定保护作用，不仅可使缺血再灌注损伤体积缩小，而且可使神经功能缺损减轻,此即“脑缺血耐受”1-2。TIA可否作为一种缺血预处理方式来保护缺血再灌注损伤的脑组织？临床上用诱发TIA作为一种治疗缺血性卒中的措施要冒引起严重脑组织损伤的危险，而且也不现实。因此，我们通过建立缺血预处理模

10、型来研究缺血耐受机制，以期发现一种更好、更稳定的预处理方法。    1  材料与方法    1.1  实验动物及分组     健康新西兰白兔35只,雌雄不限,体质量2.23.2 kg（江苏大学动物中心提供）,自由进食和饮水，12 h昼夜节律喂养。所有动物随机分为3组:假手术组5只，显露颈总动脉4 h后关闭颈部，不做其他任何处理；缺血组10只，直接将微导丝从颈总动脉（CCA）经颈内动脉(ICA)插至大脑中动脉(MCA)起始部4 h。预处理组20只，方法同缺血组,将微导丝堵塞15

11、 min，再灌时,抽回导丝至颈总动脉内15 min，如此重复3次，之后导丝堵于大脑中动脉起始部4 h。    1.2  微导丝的制备     根据预实验选择头端直径为0.46 mm的导丝(Terumo,日本),自头端截取导丝10 cm,紫外线消毒后置于1%肝素溶液中备用。    1.3  动物模型的制作     术前动物禁食24 h,3%戊巴比妥钠（按体质量1 ml/kg)耳缘静脉麻醉，固定。取颈部正中切口, 逐层分离皮下组织,在气管旁

12、找到颈血管鞘，分离鞘膜，于甲状软骨上缘水平显露右侧颈总动脉和迷走神经。用弯镊从颈总动脉下方穿双股4-0的丝线备用，结扎颈总动脉近心端。在颈总动脉处穿入留置针，固定，注入对比剂(优维显)约5 ml,同时在数字减影血管造影（DSA）下扫描获得颈内动脉及大脑前、中、后动脉的图像，缓慢向颈总动脉插入微导丝，在DSA下观察导丝走行，经颈内动脉插至大脑中动脉起始部，当导丝头端接近大脑中动脉起始部时，放慢速度，动作轻柔，遇阻力时观察导丝头端位置，再次注入对比剂，如大脑中动脉血流被阻断即表明导丝头端已到达大脑中动脉起始部（图1）。将导丝与颈总动脉结扎固定，防止移动和出血。记录时间作为大脑中动脉阻塞开始时间,逐

13、层缝合颈部切口,留置剩余导丝,于体外再灌时抽回导丝至颈总动脉内。    图1  大脑中动脉栓塞的DSA图像    Fig 1  MCAO on DSA    1.4  模型成功的标准    动物存活，手术操作顺利,术中无大出血,麻醉反应正常,兔清醒后出现左侧肢体不同程度的偏瘫。TTC染色右侧出现不同程度无红染区及HE染色出现病理改变为模型成功的标准。未成功的实验动物,在完成所需检查或死亡后开颅取脑观察,寻找不成功或死亡原因。  

14、;  1.5  神经功能缺损体征评分    方法参考Kilic等3的报道,即5级评分法:0-正常运动功能；1-动物的躯干和病灶对侧前肢呈屈曲状态；2-动物行走时向病灶对侧作转圈运动，但在安静休息时姿势正常；3-在安静休息时动物姿势倒向病灶对侧，不能站立；4-没有自发的运动动作。    1.6  MRI检查    微导丝栓塞大脑中动脉4 h后，于再灌注1，3，6，12，24 h行MRI扫描。采用西门子Magnetom Trio Tim 3.0T MR扫描仪,动物仰卧于头线圈中央

15、,在定位相上取视交叉平面为中心层面,行冠状位连续扫描,层厚4 mm,层间距0.4 mm。部分扫描参数如下:T1WI:TR 500 ms,TE 83 ms,FOV 100 mm×100 mm,矩阵256×256；T2WI:TR 3 000 ms,TE 82 ms,FOV 100 mm×100 mm,矩阵256×256；DWI: TR 3 000 ms，TE 97 ms,在X,Y,Z轴三个方向分别施加扩散敏感梯度（b值取0，150，300，500，1000 s/mm2），FOV 100 mm×100 mm,矩阵256×256。 

16、   1.7  组织病理染色    在最后一次MR检查结束后立即用戊巴比妥钠过量麻醉将兔处死，完整取出大脑，置于冰箱中冷藏。1520 min后取出兔脑，沿冠状面均匀切成4 mm厚的脑片。脑片迅速放入2TTC（2，3，5-三苯基四氮唑）生理盐水溶液中，置入37 恒温水浴箱避光反应30 min，取出后用10甲醛溶液反复多次置换，固定24 h后进行HE染色。    2  结  果    2.1  血管造影    血管造影可清晰显示颈内动脉的走行及其颅内分支情况,如大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动脉及椎基底动脉。此外由于导丝不透X线,还可在透视下观察其位置，准确定位。当