乙型肝炎患者HBcAg特异性细胞毒性T细胞的检测及其与临床疾病

1、乙型肝炎患者HBcAg特异性细胞毒性T细胞的检测及其与临床疾病状态的关系 范振平王福生徐东平褚福亮施明周宇张玲霞作者单位：100039 北京，解放军第三二医院生物治疗研究中心（范振平、王福生、徐东平、褚福亮、施明、周宇），专家组（张玲霞）通讯作者：王福生，Email: fswang 【摘要】目的通过定量分析HLA-A*2402限制性的乙型肝炎病毒(HBV)特异性的细胞毒性T细胞(CTL)来研究急性自限性和慢性持续性乙型肝炎患者体内免疫反应的差异。方法 从急性和慢性乙型肝炎感染患者外周血中提取外周血单个核淋巴细胞（PBMC），用HLA-A*2402-HBV肽链四聚体复合体染色

2、后，用流式细胞仪检测HBV特异性CTL细胞。同时使用酶联免疫斑点法来检测部分患者的CTL细胞分泌干扰素(IFN)-的水平。 结果 在7例急性乙型肝炎的急性期，可以检测到高水平的HBV特异性的CTL细胞，而在急性乙型肝炎的恢复期，HBcAg特异性CTL细胞的水平可以明显下降。在13例慢性乙型肝炎患者中，除了1例慢性肝炎急性暴发患者之外，均不能检测到HBcAg特异性CTL细胞。IFN-的分泌与这些结果相一致。结论HBcAg特异性CTL细胞在急性肝炎患者清除乙型肝炎病毒的过程中可能起到至关重要的作用。【关键词】T淋巴细胞，细胞毒性；HLA抗原；肝炎，乙型；pMHC-四聚体 急性乙型肝炎患者

3、体内存在多特异性的和多克隆特异性的细胞毒性T细胞（CTL），而慢性乙型肝炎患者体内的特异性的CTL却恰恰相反1。在慢性乙型肝炎病情急性加重时可以检测到CTL细胞数量相应增加2。由此可见，针对乙型肝炎病毒(HBV)抗原特异性的CTL在清除病毒和引起肝脏病理损害的过程中起着重要作用3,4。就HBV而言，人类白细胞抗原(HLA)限制性多肽（或称之为抗原表位）存在于HBV蛋白质抗原的多肽链中，目前在HBV特异性CTL识别的21个HBV表位中，有16个是HLA-A2限制性的1-5。目前见到有关针对HBV特异性CTL的临床免疫学研究的报道较少。此外HLA-A*2402是我国人口中常见的HLA-型等位基因之

4、一6，7。我们使用HLA-A*2402-HBV肽链-四聚体复合体在国内首次分析HBV感染的患者外周血中核心抗原特异性的CTL细胞并分析了它的临床意义。 对象与方法一、对象HLA-A24阳性的急性乙型肝炎患者7例，其中男4例、女3例，平均年龄24.4岁±3.9岁，丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平（1031 U/L±157 U/L）；慢性乙型肝炎患者13例，其中男11例、女2例，平均年龄29.7岁±2.5岁，ALT水平为（129 U/L±122 U/L），均来自解放军第三二医院门诊和住院患者。对照组选择年龄和性别相仿的HLA-A24阴性的6例急性乙型

5、肝炎患者以及17例慢性乙型肝炎患者。所有患者的诊断标准均符合2000年第六届传染病和寄生虫病会议（西安）制定的肝炎诊断标准8。急性乙型肝炎的诊断基于ALT升高（至少高于正常上限10倍），既往没有乙型肝炎病史，血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性，同时血清中抗HBcIgM阳性,急性肝炎患者发病6个月内转氨酶恢复正常，从血清中清除HBsAg和HBeAg。慢性乙肝患者的诊断依据是：HBsAg阳性超过6个月，且伴有ALT轻中度升高。所有患者均为HCV、HDV和HIV病毒抗体阴性。二、方法1. 病毒学测定：HBsAg，抗HBs, HBeAg , 抗HBe, 抗HBc, 抗HBcIgM, 抗HDV，抗H

6、CV，抗HIV的检测试剂购自深圳达安公司，血清中HBV DNA水平检测使用深圳市匹基生物工程有限公司生产的乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测试剂盒，具体步骤按照说明书操作进行。2. HLA-A24分型：用顺序特异引物聚合酶链反应技术（PCR-SSP）9对所需病例进行筛选，所用引物由赛百盛公司合成。3. 藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的HLA-I四聚体复合体的合成：PE标记的HLAA*2402-HBV肽链四聚体复合体(HBV肽链选自HBV核心抗原第117125氨基酸,序列为EYLVSFGVW,以下简写为HBV-C117-125)和PE标记的小鼠的IgG1抗体做为阴性对照，均购自英国P

7、roImmune公司。抗-CD8-异硫氰酸荧光素（FITC）单抗购自美国BD公司。同时为排除HLA-A*2402-HBV肽链四聚体的非特异性连接，我们使用HLA-A24阴性的肝炎患者作为阴性对照，估计在所有CTL细胞中,非特异性检出率平均<0.04%（平均值±3标准差）10。4. pMHC-四聚体流式细胞分析：（23）×105个新鲜分离的外周血单核淋巴细胞(PBMC)，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，加入1lHLAA*2402-HBV肽链四聚体复合体和10l抗-CD8-FITC单抗染色,在4条件下孵化30 min，然后再用PBS洗涤2次，之后悬浮在300 l PBS

8、中，使用FACS Calibur仪器进行流式检测，收集细胞数为(11.5)×105个，用美国BD公司的Cell Quest 软件进行分析。HBV特异性的CTL细胞的阳性率（%）=四聚体+CD+8/CD+8×100%。5. 酶联免疫斑点法（ELISPOT）法检测HBV特异性CTL细胞产生干扰素（IFN）的频率11：用抗IFN-单克隆抗体4过夜，包被底部为PVDF的96孔板，包被后的96孔板用封闭液封闭2 h。将实验设为阳性对照组、阴性对照组和实验组，阳性对照每孔加入1 g/100 l的植物血凝素，阴性对照组加培养液，实验组加终浓度为10 g/ml的HBVcore117-125

9、肽链，每组设两个复孔，加2×105个PBMC/孔，37孵箱培养20 h，弃掉细胞，洗涤后加入生物素化的检测抗体，37孵箱培养1.5 h，洗涤后加入碱性磷酸酶标记的链酶亲和素，37放置1 h,洗涤后加BCIP/NBT显色液，室温避光反应25 min,斑点出现后用蒸馏水冲洗终止反应。显色后的96孔培养板室温避光放置，干燥后在ELISPOT酶链斑点图像分析仪上记数斑点。每一个斑点代表一个产生IFN-的细胞，计数斑点形成细胞（SFC）数，并将每孔测得值减去阴性对照测得值，以SFC/10-6PBMC为单位计算。6. 统计分析：数据以±s表示，样本均数比较采用t检验，使用SPSS10.

10、0软件进行统计学分析。结 果1. 急性乙型肝炎患者外周血中的HBcAg特异性的CTL细胞的检测及动态变化：我们检测的结果提示HLA-A*2402阳性的7例急性乙型肝炎患者中HBVcore117-125四聚体阳性的CTL细胞的阳性率为0.15 %±0.03%，HLA-A*2402阳性的13例慢性乙型肝炎患者中为0.03%±0.02%。使用流式细胞检测急性和慢性乙型肝炎患者HBV特异性的CD+8的T细胞有很好的可行性（图1）。我们还同时测试了6个HLA-A24阴性的急性乙型肝炎和17个HLA-A24阴性的慢性乙型肝炎PBMC中四聚体阳性的CTL细胞，他们的阳性率均是0.02%&

11、#177;0.006%。HLA-A24阳性的急性乙型肝炎中四聚体阳性CTL细胞的阳性率与其他3组相对照，差异有显著意义图1急性和慢性患者四聚体流式检测比较图（P<0.05）。这些患者外周血中特异性的CTL细胞的数量不低于文献报道的HLA-A*0201限制的HBV表面抗原第335343氨基酸和多聚酶第575583氨基酸特异性的CTL细胞12，表明HBVcore117125是CTL细胞主要的免疫决定表位之一。对于HLA-A*2402阳性的部分患者：急性乙型肝炎患者5例，慢性乙型肝炎10例进行了ELISPOT检测，急性乙型肝炎患者产生IFN-的HBV特异性的CD8+细胞的频率均值为（45

12、77;18）SFC/106PBMC，显著高于HLA-A*2402阳性慢性乙型肝炎患者（23±18） SFC/106PBMC，(P<0.05)。我们还对1例急性乙型肝炎患者（AHB2）进行了为期12周的随访，发现患者在治疗前，ALT 913 U/L，HBsAg阳性，四聚体阳性的HBcAg特异性的CTL细胞的百分比是0.15%；4周后，ALT降为60 U/L,CTL细胞的百分比也降低至0.04%；到第12周后肝功能已经降至正常水平，CTL细胞的百分比为0.02%。说明患者外周血四聚体阳性的CTL细胞的数量在恢复期明显下降。急性乙型肝炎患者的四聚体阳性的CTL细胞数量高，而且这些患者

13、的HBV DNA水平明显低下或者阴性，提示HBV特异性的CTL细胞数量与乙型肝炎病毒DNA复制水平呈现明显的相关性（表1）。 表1进展期急性乙型肝炎患者临床资料编号性别年龄ALT（U/L）AST（U/L）HBVDNA（拷贝/ml）HbeAg四聚体阳性CTL细胞（%）ELISPOTSFC/106PBMC1男27770212<104-0.12652女189134829.83×104+0.15未测3女251204439<104-0.12304男251038186<104+0.10255男30991432<104+0.18426男241101521<1

14、04+0.16657女211201412<104+0.21未测 2. 慢性肝炎患者中的PBMC中HBcAg特异性的CTL细胞分析：用流式细胞仪分析13个HLA-A*2402阳性的慢性HBV感染的患者中的HLA-A*2402阳性的CTL细胞。仅在患者CHB8可以检测到四聚体阳性的CTL细胞。而该患者是慢性肝炎的急性暴发。患者CHB11和CHB13也可以检测到低水平的四聚体阳性的CTL细胞。慢性乙型肝炎患者CHB8、CHB11和CHB13的HBV DNA表现为低水平的复制(<106拷贝/ml)。而在不能检测到四聚体阳性的CTL细胞的慢性乙型肝炎患者中，大部分表现为HBV DN

15、A高水平的复制（106拷贝/ml）。因此，我们的体外分析结果表明慢性HBV感染的患者HBcAg特异性CTL细胞的数量比急性HBV感染患者低得多。有研究认为，在血清中HBV DNA的含量水平低时，HLA-A2阳性的乙型肝炎携带者患者外周血中C18-27特异性的CTL细胞可以在体外扩增，而HBV DNA高水平者则不能12。说明HBV特异性的CTL细胞可以抑制HBV DNA的复制。 讨 论在四聚体出现之前，对于病毒特异性的CTL检测最常用的方法是限制性稀释分析方法（LDA），这种方法需要将CTL前体细胞（pCTL）经历至少1011轮的增殖，历时67 d，然后才能检测CTL的活性，此法费时费

16、力，而且常常低估循环中的病毒特异性的CD8+的T细胞的数量。PMHC-四聚体可以连接抗原特异性的T细胞，能对CD8+的T细胞进行直接计数，简便、快捷和准确。如果联合测量IFN-的ELISPOT和细胞内因子分析方法，就可以对T细胞功能进行很好的研究13。Sobao等7研究证明，乙型肝炎病毒的C117-125是主要的免疫表位区之一，我们将四聚体和ELISPOT方法结合应用到乙型肝炎患者的研究中，结果发现，在急性乙型肝炎患者的外周血PBMC中，有较高水平的HBcAg特异性的CTL。而在HLA-A*2402阴性的急性和慢性乙型肝炎患者中的血PBMC中，HBV特异性的CTL细胞含量明显降低，表明四聚体和

17、ELISPOT是非常有用的检测HBV特异性的CTL的方法，两者结合可以有效的检测乙型肝炎患者CTL细胞的数量和功能14。该结果与Sobao等10和Webster等15的研究结果一致。值得重视的是，在急性乙型肝炎和部分慢性乙型肝炎患者体内，能检出较高水平的CTL，而且在急性乙型肝炎患者,这些细胞分泌IFN-的功能明显高于慢性乙型肝炎患者。同时动态分析表明CTL水平的高低与病毒的清除和ALT水平之间有一定的联系，这可能更进一步证明了CTL在体内直接发挥清除病毒的作用16。也有人认为尽管HBV特异性的CD8+的细胞在慢性活动性的外周血中容易被检测到，但与ALT水平和病毒的数量没有直接的关系17。目前

18、认为CTL作用的机制可能为先识别HBV感染肝细胞表面相应的HBcAg表位，然后发挥以下两种抗病毒作用：其一可能直接杀伤部分HBV感染的肝细胞；其二可能是分泌内源性的IFN-和TNF-，后者通过非细胞溶解的机制清除肝细胞中的病毒。不过目前尚不清楚机体通过什么方式来控制和调节以上两种不同抗病毒的途径3。在肝脏没有炎症和低水平复制的慢性持续性肝炎患者外周血中，HLA-A*0201-四聚体-HBV特异性的CTL细胞数量要高于有肝脏炎症和肝脏高水平复制的患者。这个结果进一步证明CTL细胞在乙型肝炎病毒清除上的重要作用12。本研究也有同样的结果。因此，这两个研究结果表明HBV特异性CTL细胞可以控制慢性持

19、续性乙型肝炎患者的病毒复制。Sobao等10认为HLA-A*2402-HBV肽链四聚体复合体阳性的CTL细胞主要以CD28+CD45RA-的CTL细胞为主；也有报道指出，浸润在肝脏中的丙型肝炎特异性的CTL细胞表达激活的表型，而在外周血中的CTL细胞激活标志阴性18；在慢性乙型肝炎，使用拉米夫定降低病毒载量后，HBV特异性CTL细胞反应可以被重新建立19。这些情况都需要进一步证实。此外，本研究观察的急性乙型肝炎患者的病例数量偏少，需要进一步扩大病例研究。总之，研究表明，使用HLA-A*2402-HBV肽链四聚体和ELISPOT方法，发现在急性肝炎患者中的PBMC中有高水平的HBV特异性CTL细

20、胞，这些细胞可能与控制乙型肝炎病毒的复制及病毒的清除有关。 参考文献1 Penna A, Chisari FV, Bertoletti A, et al. Cytotoxic T lymphocytes recognize an HLA-A2 restricted epitope within the hepatitis B virus nucleocapsid antigen. J Exp Med，1991，174:1565-1570.2 Lok AS, McMahon BJ. Chronic hepatitis B. Hepatology，2001，34:1225-1241.3

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