SERS 标记的金纳米棒探针用于免疫检测

1、2009年第 67卷 化 学 学 报 V ol. 67, 2009第 14期 , 16031608 ACTA CHIMICA SINICA No. 14, 16031608 Received March 2, 2009; revised April 5, 2009; accepted May 7, 2009.国家自然科学基金 (Nos. 20603008, 20873037和湖南省自然科学基金 (No. 06JJ3006资助项目.1604化 学 学 报 V ol. 67, 2009荧光谱峰较宽 , 信号的选择性相对较差 ; 若用荧光分子 标记 , 还存在光解和光致褪色现象 , 因而荧光标记技术

2、 亦有其局限性 . 基于表面增强拉曼散射 (SERS的 SERS 标记技术是一种光谱标记技术 , 始建立于 20世纪 80年 代末 8. 它利用金或银等贵金属纳米颗粒来增强 /放大表 面吸附的拉曼活性分子的拉曼信号 (即 SERS, 以拉曼 活性分子的 SERS 信号作为读出示踪信号 . 近年来随着 纳米科技的快速发展 , SERS标记技术已引起了国内外 科学家的广泛关注 9,10. 首先 , 拉曼光谱具有高度的分 子特征性 , 且谱峰窄 , 能减小不同分子间的谱峰重叠 . 其次 , 在多元检测中一种波长的激发光就能激发出不同 的拉曼活性分子的谱峰 . 第三 , SERS信号很少受光漂白 的影

3、响 , 可在一定程度上为获得较好的 SERS 信号而延 长积分时间 . 第四 , SERS信号不象荧光分子那样易发生 自淬灭现象 , 可通过增加拉曼活性分子数目来提高信号 强度 , 从而提高免疫检测的灵敏度 .目前 , SERS免疫检测呈现几个基本的发展趋势 11. 第一 , 如何解决 SERS 标记免疫探针在固体基底上非特 异性吸附造成的 “假阳性” 问题 . SERS免疫检测的基本 方法是标记抗体 , 待测抗原和俘获抗体之间形成“三明 治”夹心结构 . 理想情况下 , 探针上的抗体通过抗体和 抗原之间的特异性免疫反应连接到俘获抗体上 . 除此以 外的吸附为非特异性吸附 , 由此造成假阳性和

4、背景信号 升高等 . 通常可利用牛血清白蛋白来封闭固体基底上的 空位以减少非特异性吸附 . 第二 , 实现从单组分到多组 分检测 . Ni等 12最早尝试了双组分检测 . 国内顾仁敖课 题组 13也成功地进行了二组分检测 , 并初步进行了三 组分检测的尝试 11. 第三 , SERS探针的表面修饰 . SERS纳米探针的表面修饰可以减少标记分子从纳米颗粒表 面脱落 , 提高信号的稳定性 , 并能有效减少探针的非特 异性吸附问题 . 除此以外 , 探针还应具备水溶性、抗团 聚和生物亲和性的特点 . 目前 , 表面修饰的发展趋势是 从第一代裸纳米颗粒探针 1215到第二代的 SiO 2修饰的 探针

5、 10, 再到第三代高分子包覆的纳米探针 16. 我们在 前期的工作中已明确 : 可将胶体的空间稳定理论作为设 计制备各类纳米探针的理论依据 17, 即将生物亲和性 高分子吸附在纳米颗粒 /探针上 , 以其提供的空间稳定 来取代探针原来的电荷稳定机制 . 由于稳定机制不同 , 高分子稳定的纳米探针可以耐受高浓度盐等苛性条件 而不团聚 , 还可提供水溶性和生物亲和性等诸多优异的 性能 . 第四 , 提高免疫检测的灵敏度 . 由前述 SERS 免 疫检测的基本方法可知 , 提高免疫检测灵敏度实际上就 是要提高 SERS 信号强度 . 因此通常选择具有较大拉曼 散射截面的分子作为标记分子 . 除此以

6、外 , 另一个方案 是全面借鉴 SERS 领域的研究成果 , 采用具有较强增强 能力的纳米颗粒来制备探针 . 如 Porter 等 18采用 60 nm的金颗粒来制备 SERS 免疫探针 . Cao等 19和徐等 20,21则利用银染色技术来提高 SERS 信号 . Cui等 22采用表面 具有孔洞的银核金壳颗纳米粒子来制备探针 . Ji等 23则 采用金核银壳纳米颗粒来制备探针 , 可通过改变 Au/Ag核与壳的厚度从而获得强的 SERS 信号 . Sanles-Sobrido等 24采用颗粒聚集体来制备探针 .金纳米棒有着独特的光学性质 , 并且在医学、传感 和化学分离等方面有很好的应用前

7、景 , 近年来已成为人 们研究的热点 25. 金纳米棒有两个等离子体共振 (SPR吸收带 : 横向 SPR 吸收峰和纵向 SPR 吸收峰 , 其中纵向 等离子体吸收峰的位置可以随其长径比的增大而逐渐 红移 25. 金纳米棒 SPR 的这种可调性使其能作为很好 的 SERS 基底 . 因为按照 SERS 的电磁场增强机制 , 当激 发光和 SPR 共振时 , 可以最大程度提高单个纳米颗粒的 增强能力 26. 我们最近的实验和理论计算也证实 : 当金 纳米棒纵向 SPR 与 632.8 nm的激发光耦合时 , 其增强能 力确实比耦合程度小或没有耦合时强 27. 因而 , 我们制 备了长径比为 2.

8、5的金纳米棒 , 使其纵向 SPR 和 632.8 nm 的激发光耦合 . 并以此金纳米棒来制备 SERS 纳米探 针 , 进行 SERS 免疫检测研究 .1 实验部分1.1 实验试剂氯金酸、十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB、硼氢化 钠、硝酸银、抗坏血酸 (AA均为分析纯 , 购自上海国药 集团化学试剂有限公司 . N , N' -二环己基碳酰亚胺 (DCC为分析纯 , 购自上海共价化学科技有限公司 . 对巯基苯 甲酸 (MBA、 3,3'-二硫代二丙酸 (99%、 N -羟基丁二酰亚 胺 (NHS购自 Aldrich 公司 . 羊抗鼠 IgG 、小鼠 IgG 、牛 血清蛋白

9、(BSA, PBS缓冲液 (pH=7.2 购自北京鼎国生 物 技 术 有 限 责 任 公 司 . -甲 氧 基 -巯 基 聚 乙 二 醇 (mPEG-SH, M W =5000 由北京建凯科技有限公司特定 合成 . 四氢呋喃 (THF、 丙酮、 正己烷购自天津大茂化学 试剂有限公司 . 玻璃镀金基底由中国科学院安徽光学精 密机械研究所提供 . 先在清洗干净的玻璃片基底上真空 镀上 Ni-Cr 层 , 其上再镀上金 . 实验用水为 Mini-Q 超纯 水 , 电阻率大于 18.0 M cm -1.1.2 3,3'-二硫代二丙酸丁二酰亚胺酯 (DSP的制备 0.4836 g 3,3'

10、;-二硫代二丙酸 (2.3 mmol溶于 50 mL THF 中 , 向其中加入 0.575 g (5 mmol NHS, 在 0 下再 加入 1.03 g DCC (5 mmol, 在冰浴条件下搅拌反应 36 h. 过滤除去副产物 N , N' -二环己基脲 (DCU, 将滤液旋转蒸 发除去 THF. 用丙酮 /正己烷重结晶两次后得到白色固No. 14 郭红燕等:SERS 标记的金纳米棒探针用于免疫检测 1605体 DSP.1.3 金纳米棒的制备实验所用的金纳米棒溶胶采用种子生长法合成 28. 第一步种子的制备 : 向 7.5 mL 0.05 molL -1 CTAB中加 入 0.1

11、2 mL 2.037×10-2 molL -1 HAuCl4溶液 , 轻轻摇 匀 . 迅速向其中加入 0.6 mL 0.01 molL -1冰浴冷却的 NaBH 4溶液 , 剧烈振荡 2 min. 然后将制得的金纳米种 子在 40 的水浴中静置老化 2 h后使用 . 第二步金纳 米棒的生长 : 向 30 mL 0.05 molL -1 CTAB中加入 40 µL 0.01 molL -1的 AgNO 3溶液 , 振荡 1 min. 再向其中加入 0.74 mL 2.037×10-2 molL -1的 HAuCl 4溶液 , 轻轻摇匀 . 然后再迅速加入 0.24

12、mL 0.1 molL -1的 AA 溶液 , 剧烈 振荡至溶液变为无色 . 最后加入 0.3 mL上述金种子 , 轻 轻振荡 2 min后 , 静置 3 h, 让金种子生长成金纳米棒 . 离心 (10000 rmin -1, 12 min洗涤金纳米棒两次后 , 将纯 化后的金纳米棒分散在超纯水中备用 .1.4 免疫金纳米棒探针的制备向以上合成的 1 mL 金纳米棒溶胶中加入 10 µL 1.0×10-3 molL -1 MBA, 反应 4 h, 让拉曼活性分子 MBA 充分吸附到金纳米棒上 . 在这一步中要仔细控制加入 MBA 的量 , 使之只部分占据金纳米棒表面 (约占

13、据 1/2, 为后续抗体吸附预留足够的空位 . 然后向吸附 MBA 分 子的金纳米棒溶胶中加入过量羊抗鼠 IgG(2 mgmL -1, 分散于 0.01 molL -1, pH=7.2的 PBS 缓冲溶液中 , 室温 下反应 1 h. 再向其中加入 6 µL 3.425×10-4 molL -1的 mPEG-SH 来封闭金纳米棒表面剩余空位 . 为防止游离 的 MBA 、 羊抗鼠 IgG 和 mPEG-SH 的干扰 , 将制备好的 免疫金纳米棒探针从溶液中离心分离出来 , 再重新分散 在超纯水中备用 .1.5 SERS标记抗体 -待测抗原 -俘获抗体“三明治” 结构的组装玻

14、璃镀金基底在使用前依次在超纯水、 乙醇、 丙酮、 氯仿、 丙酮、 乙醇和超纯水中超声洗涤 5 min, 烘干后放 入 1×10-4 molL -1的 DSP 乙醇溶液中 , 室温下浸泡 12 h. 用乙醇洗去基底表面未吸附的 DSP 后 , 氮气吹干 . 将 DSP 修饰的镀金片放入 0.05 mgmL -1羊抗鼠 IgG PBS 缓冲溶液中 , 于 4 下放置 12 h. 用 PBS 缓冲液冲 洗基底 , 除去未吸附的抗体 . 再将其浸入 2%的 BSA 溶 液中 , 4 下放置 1 h, 封闭表面剩余空位 , 以减少非特 异性吸附 . 用大量 PBS 缓冲液清洗基片 , 然后保存

15、在 4 下的 PBS 缓冲溶液中 .将基片氮气吹干后放在 200 µL不同浓度的小鼠 IgG PBS缓冲溶液 (0.01 molL -1, pH=7.2 中振荡 24 h. 取出后先用大量的 PBS 缓冲溶液充分冲洗基底 , 再 用超纯水冲洗 , 并用氮气吹干 . 将小鼠 IgG 修饰的基底 浸入标记免疫金纳米棒溶胶中 , 室温下放置 6 h. 取出 基底 , 用超纯水充分冲洗后用氮气吹干 , 形成 “三明治” 夹心结构备用 .1.6 测试仪器金纳米棒粒子的形貌表征在 JEM-1230型 (JEOL公 司 透射电镜 (TEM上进行 . 紫外-可见光谱在 UV2300型 (上海天美科学

16、仪器有限公司 光谱仪上进行 . 基底表 面形貌在 JSM-6700F 扫描电子显微镜 (SEM上进行 . 水力半径在 Zetasizer 3000HS型 (英国 Malvern 公司 Zeta 电位粒度仪上测定 . SERS光谱在共焦显微拉曼光谱仪 LabRAM HR(法国 Jobin Yvon公司 上进行 . 激发波长为 632.8 nm, 所有光谱均为一次 10 s积分时间采集 .2 结果与讨论2.1 免疫金纳米棒探针的制备和表征图 1a 为按种子生长法 28合成的金纳米粒子的 TEM 图 . 由图可见 , 除少数近似为球形的粒子难以从溶胶中 离心分离以外 , 绝大多数金纳米粒子为棒状 .

17、 统计约 150 个纳米棒 , 计算出其平均长径比 (棒长轴与短轴之 比 约为 2.5. 通过电感耦合等离子体 (ICP可以测出金纳 米棒溶胶中金元素的含量 . 再根据 TEM 图 , 把纳米棒 看成一个两端分别为半球状的圆柱体 . 从而计算出溶液 中金纳米棒的粒子数密度为 1.12×1012个 /mL. 单个标 记分子 MBA 所占据的面积约为 20 Å229. 据此可估算出 所需加入 MBA 的量 , 使其约占据金纳米棒表面积的 1/2, 以便留出足够的空位来吸附抗体 . 图 1b 为依次吸 附 MBA 和抗体后的金纳米棒的 TEM 图 , 和图 1a 相比 , 金纳米

18、棒之间的距离增大 , 溶胶的分散性有了明显改 善 . 这是由于大分子蛋白质体积较大 , 当它通过静电 /化 学键吸附到金纳米棒上时 , 可能会通过空间位阻阻碍棒 与棒之间进一步接近 . 图 1c 为依次吸附 MBA 和抗体 , 表面空位再用 mPEG-SH 封闭后的金纳米棒探针的形态 . 由图可看出其分散性有了进一步改善 . 在制备探针时 , 通常也是采用 BSA 来封闭探针颗粒表面的空位 , 以减 少探针与固体基底表面的非特异性吸附 18. 由于 PEG 链节是不带电的中性基团 , 对蛋白有很强的抗吸附能 力 30. 如 Kim 等 31将 PEG 接枝到生物素修饰的聚赖氨 酸上 , 有效抑

19、制了聚赖氨酸对蛋白的非特异性作用 . 其 次 , mPEG-SH比 BSA 体积小 , 能更有效地封闭空位 . 故我们采用 mPEG-SH 来封闭空位 , 以降低探针的非特 异性吸附 . mPEG-SH以巯基基团吸附到金纳米颗粒表 面 , 其直链 PEG 链节则向外伸展到溶液中 . 显然 , 如果 PEG 链的长度比探针上吸附的抗体的直径大 , 则会干扰1606化 学 学 报 V ol. 67, 2009 抗体与待测抗原的结合 . 为此 , 我们采用 mPEG-SH 和 抗体分别单独修饰 70 nm 金溶胶 , 并测量其水力半径 . 结果显示 PEG 修饰的金纳米粒子水力半径增大了约 9 nm

20、, 而抗体修饰的金纳米粒子则增大了 50200 nm以 上 . 说明用 mPEG-SH 封闭空位不会干扰探针上的抗体 与溶液中待测抗原的结合.图 1 纯态金纳米棒 (a、 MBA 和羊抗鼠 IgG 修饰的金纳米棒 (b和 MBA, 羊抗鼠 IgG 和 mPEG-SH 修饰的金纳米棒 (c的 TEM 图Figure 1 TEM images of pure gold nanorods (a, MBA and goat anti-mouse IgG modified gold nanorods (b, and MBA, goat anti-mouse IgG, and mPEG-SH modifi

21、ed gold nanorods (c由于 SERS 免疫检测的基本方法是将 SERS 免疫探 针与俘获抗体通过待测抗原组装成“三明治”式的夹心 结构 , 探针 SERS 信号的强弱反映待测抗原浓度的高低 . 因而 , 探针在制备过程中和在“三明治”夹心结构中应 保持分散态 , 避免团聚 . 如果探针纳米颗粒团聚 , 则探 针之间的耦合会进一步提高 SERS 信号强度 26, 造成 “假阳性” , 即待测抗原浓度出现正偏差 .我们利用紫外-可见吸收光谱来监测探针制备过程 .图 2曲线 a 为纯态金纳米棒溶胶的紫外-可见吸收光谱 . 金纳米棒的紫外-可见吸收谱有两个 SPR 共振吸收带 : 位于

22、低波数段的横向 SPR 吸收峰和位于长波数处的纵 向 SPR 吸收峰 25. 通过增大长径比 , 可将金纳米棒纵向 SPR 峰位置从可见光区调至近红外光区 . 我们在以前的 工作中证实 : 纵向 SPR 与 632.8 nm的激发光耦合程度 越大 , SERS信号越强 27. 本实验中就选用长径比为 2.5的金纳米棒 , 通过其 SPR 和拉曼光谱仪 632.8 nm的激光 耦合来提高 SERS 信号 . 图 2b, 2c和 2d 显示 , 金纳米棒 上依次吸附 MBA 、 抗体和 mPEG-SH 后 , 其纵向峰 SPR 峰位置稍红移 . 但在长波数方向没有出现新的聚集体的 吸收峰 , 说明

23、无团聚现象 . 图 2e 是离心清洗后的免疫探 针 (除去未吸附的杂质 的紫外-可见光谱 . 离心后弃去 上层清液会损失一部分金纳米棒 , 导致纵向 SPR 吸收峰 的强度降低 . 同时纵向和横向 SPR 吸收峰强度的比例比 离心前有所下降 , 其原因尚不清楚 . 若免疫探针发生团 聚 , 则在纵向 SPR 长波数方向出现明显的新吸收峰 , 因 而从图 2e 可判断免疫探针没有团聚 . 我们在实验中仔 细控制探针的制备条件 , 并采用紫外-可见光谱监测 , 选用非团聚的探针用于后面的免疫检测.图 2 纯态金纳米棒 (a, MBA修饰的金纳米棒 (b, MBA和羊 抗鼠 IgG 修饰的金纳米棒

24、(c, MBA, 羊抗鼠 IgG 和 mPEG-SH 修饰的金纳米棒 (d和 (d中的金纳米棒经离心清洗后重新分散 在超纯水中 (e的紫外-可见光谱Figure 2 UV-vis spectra of pure gold nanorods (a, MBA modified gold nanorods (b, MBA and goat anti-mouse IgG modified gold nanorods (c, MBA, goat anti-mouse IgG, and mPEG-SH modified gold nanorods (d and the gold nanorods that

25、 were centrifugation-purified from (d and then redispersed in ultrapure water (e2.2 “ 三明治 ” 结构的表面状态表征和 SERS 免疫检测我们采用 DSP 来修饰镀金基底 . 它通过二硫键断 裂 , 形成 Au-S 键组装在金基底上 . 其活性酯键则可以 和抗体上的 NH 2反应 , 从而将抗体组装在金基底上 . 用No. 14 郭红燕等:SERS 标记的金纳米棒探针用于免疫检测 1607DSP 处理的基底有利于抗体在基底表面的直立排列 , 从 而更好地捕捉待测抗原 . 图 3a 是抗体修饰后的金基底 , 图

26、中插图是未经任何修饰的空白基底 . 图 3b 是俘获抗 图 3 DSP-抗体修饰的金基底 (图中插图是空白的金基底 (a, DSP-抗体-抗原修饰的基底 (b, 抗原浓度为1×10-4 mgmL -1时“三明治”结构 (图中插图是抗原浓度为 0时的情况 (c和 抗原浓度为 1×10 mgmL -1时“三明治”结构的 SEM 图 (d Figure 3 SEM images of (a DSP-goat anti-mouse IgG modi-fied gold substrate (the inset is the SEM image of bare Au sub-stra

27、te without any modification, (b DSP-goat anti-mouse IgG-mouse IgG modified gold substrate, (c sandwich structure assembled at mouse IgG concentration of 1×10-4 mgmL -1 (the inset shows the SEM image for the case without addition of mouse IgG, and (d sandwich structure assembled at mouse IgG con

28、centration of 1×10 mgmL -1 体 (即修饰在金基底上的抗体 和抗原反应后基底的 SEM 图 . 由图可见 , 抗原在金基底上呈岛状分布 . 图 3c 和 3d 是经免疫反应组装出的 “三明治” 夹心结构的 SEM 图 . 当无抗原时 , 金基底上几乎看不到金纳米棒探针 (图 3c 中插图 , 说明非特异性吸附不明显 . 随着抗原浓 度的增加 , 金基底上开始出现金纳米棒探针 (图 3c. 在 高浓度抗原条件下 , 探针在基底上的数目较多 , 分布比 较均匀、分散 , 较大程度上减少了棒与棒之间的聚集 /耦合 (图 3d.图 4是镀金基底上组装的 SERS 标记

29、抗体-待测抗 原-俘获抗体 “三明治” 夹心结构的 SERS 光谱图 . 实验 中采用一系列不同浓度的待测抗原来组装“三明治”夹 心结构 . 从图中可看出 , 随着抗原浓度的增大 , MBA的 SERS 信号逐渐增强 . 因而 , SERS信号变化说明抗原-抗 体的结合属于特异性吸附 . 与 SEM 观察一致 , 当抗原浓 度为 0, 图中的 SERS 信号很弱 . 说明用 mPEG-SH 封闭 探针表面剩余空位 , 确实可以有效抑制非特异性吸附 . 在同样的实验条件下 , 当用 BSA 封闭空位的探针做检 测时 , 其非特异性吸附要强一些 . 这可能是由于 BSA 表 面有大量的官能团可与基

30、底作用 . 图 5是 SERS 峰 1073 cm -1的积分面积与抗原浓度的关系图 . 由图可见 , 能检 出的抗原浓度范围高于 1×10-8 mgmL -1 .图 4 不同浓度小鼠 IgG 组装出的 “三明治”结构的 SERS 光 谱Figure 4SERS spectra of the sandwich structures assembled at varying mouse IgG concentrations3 结论我们以具有较大拉曼散射截面的对巯基苯甲酸作 为 SERS 标记分子 , 以金纳米棒来制备免疫探针 , 制得 了 SERS 标记抗体-待测抗原-俘获抗体的“三明

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