STR－PCR分析嵌合体在同种异基因造血干细胞移植中的应用

1、STRPCR分析嵌合体在同种异基因造血干细胞移植中的应用                作者：孙敬芬韩晓苹赵丹丹汪菲菲靳海杰高春记达万明于力【摘要】  利用荧光标记的多重PCR扩增短串联重复序列(STRPCR)结合毛细管电泳检测供者细胞嵌合率(DC),以探讨该方法的连续检测对异基因造血干细胞移植(alloHSCT)后转归的预警作用， 采集27例清髓性外周血干细胞移植患者移植前、移植后不同时段的外周血或骨髓，DNA样本用Profiler Plus和

2、Cofiler Plus商品化试剂盒扩增后,用ABI310遗传分析仪进行毛细管电泳,确定基因位点及峰面积,根据基因型的差异选择嵌合率计算公式。结果表明： 两种试剂盒测得的DC嵌合率一致;在27对中能区别出供受差别的STR位点，Profiler Plus为6.3(4-9)个, Cofiler Plus为4.9(2-6)个。26例患者均在移植后28天出现供者细胞，1例患者未出现供者细胞。14例患者DC 100%,均获得持久植入,至今仍无白血病生存；另有9例患者出现不稳定混合嵌合(MC)状态(DC为0%-90.2%),其中5例为血液学复发。27例病人中有6例死亡。上述5例复发患者均在出现临床症状前发

3、生DC量下降;供者细胞完全嵌合组移植物抗宿主病(GVHD)的发生率高于MC组。结论：动态检测DC可用于移植动力学研究,对移植物早期植入或被排斥、疾病复发以及GVHD的发生均有预警作用,对早期实施临床干预治疗有重要的指导意义。 【关键词】  同种异基因造血干细胞移植； STRPCR; 毛细管电泳; 嵌合体Application of Chimerism Analysis to Allogeneic Hematopoietic Stem Cell  Transplantation by STRPCR   Abstract   The ai

4、m of this study was  to analyze chimerism,  evaluate the status of engraftment and predict the outcome of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (alloHSCT)  multiple short tandem repeat (STR) amplification using  fluorescence labeling polymerase chain reaction (PCR) c

5、ombined with capillary electrophoresis.   Peripheral blood and bone marrow in 27 patients who received myeloablative allogenetic cell transplantation  were collected before and after transplantation in different times. 10 and 7 different STR markers were coamplified in a single reacti

6、on by using a commercial AmpF/STR Profiler Plus/Cofiler plus PCR amplification kits. Separation of the PCR products and fluorescence detection were performed by ABI prism 310 Genetic Analyzer with capillary electrophoresis. The Genescan and Genotype soft ware were used for size calling and quantific

7、ation of peak areas. The formula to calculate donor chimerism values was based on the different allelic distribution type between donor and recipient. The results showed that donor chimerism was similar by the two methods. The median number of informative alleles was 6.3(4-9) by Profiler Plus and 4.

8、9(2-6) by Cofiler Plus. The donor alleles appeared in 26 patients on day 28 post transplantation. One patient was not observed to  appear donor alleles. 14 patients with 100% donor chimerism (DC) had stable engraftment and they still survive in free leukemia. 9 patients had unstable mixed chime

9、rism (DC: 0%-90.2%), and 5 of them relapsed after alloHSCT,  6 patients died. Decrease of donor chimerism appeared  prior to graft rejection and disease relapse. The incidence of GVHD was higher in  group of full donor chimerism. It is concluded that dynamic monitoring donor chimerism

10、 by  STRPCR in combination with all autocapillary electrophoresis   is a valuable tool for predicting graft rejection, disease relapse and occurrence of GVHD, and  provides a basis for early clinical intervention in the patients received alloHSCT.   Key words  

11、; allogeneic  hematopoietic stem cell transplantation; STRPCR; capillary electrophoresis; chimerism   J Exp Hematol 2007; 15(2):337-341   同种异基因造血干细胞移植(alloHSCT)是治疗恶性血液病和免疫缺陷性疾病的有效手段之一,移植成功与否与供者细胞在受者体内的植入情况,即嵌   合体的形成有关。供者细胞嵌合率(donor chimerism, DC)的下降与移植物排斥及本病复发密切相关

12、1,因此移植后动态检测嵌合状态对判断移植效果、实施临床早期干预治疗尤为重要2。目前，嵌合体的监测已成为同种异基因造血干细胞移植术后患者的常规检测项目，检测方法已由传统的细胞学和遗传学方法发展到分子生物学方法，其中荧光标记的多重PCR扩增STR位点结合全自动毛细管电泳方法敏感性高,重复性好,简单高效,已成为目前国际骨髓移植登记处(IBMTR)推荐的检测供受嵌合状态的金标准。我们用上述方法对27例alloSCT患者嵌合状态进行了连续动态检测。   一般资料   27例病人为2005年10月-2006年7月在中国人民解放军总医院血液科及其附属304医院血液科接

13、受alloHSCT的患者,其中急性髓系白血病(AML)8例,急性淋巴细胞白血病(ALL) 2例,慢性粒细胞白血病(CML)11例,急性非淋巴细胞白血病2例，再生障碍性贫血2例，类小细胞肺癌1例，骨髓增生异常综合征1例。27例中接受同胞供者外周血干细胞移植者22例,接受无亲缘关系供者外周血干细胞移植者5例。男22例,女5例,中位年龄33.7(13-46)岁。供受者性别相合19例,性别不合8例，20例同胞供者HLA均相合;2例为父母给子女HLA单倍相合供者；非亲缘供者HLA相合4例,HLA不相合1例。   样本采集   术前采集供者和受者外周血或骨髓,术后2

14、8天采集受者骨髓,术后3个月内每月1次采集骨髓,此后每3个月1次采集受者骨髓，部分复发者每2周采集1次骨髓或外周血，肝素抗凝,4保存。   试剂和仪器    DNA抽提选用美国Promega公司DNA Purification kit试剂盒,PCR扩增试剂盒为美国应用生物系统公司(ABI) AmpF/P STR Profiler plus和Cofiler Plus商品化试剂盒,选择D3S1358、vWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820  9个基因位点和1个性别位点及D3S

15、1358、D16S539、TH01、TPOX、CSF1PO、D7S820和1个性别位点所对应的荧光标记的特异性引物同时进行复合扩增,基因位点特异性同文献3。内标Rox500及等位基因梯Ladder购自ABI公司,去离子甲烯胺购自Promega公司。主要仪器有ABI公司2400PCR扩增仪和prism310遗传分析仪,Amersham公司的GeneQuant pro紫外分光光度计。   DNA提取   采用Promega公司的DNA抽提试剂盒,按试剂盒说明程序进行基因组DNA提取，用紫外分光光度计测定DNA浓度,调整DNA终浓度为2 ng/l。 

16、  DNA扩增程序   参照文献4 PCR总体积为50 l: 扩增混合液20 l +引物混合液10 l +Taq酶5U/l +模板DNA 1 l (2 ng)。热循环参数为: 预变性95 11分钟, 94 1分钟, 59 1分钟, 72 1分钟, 28个循环,最后60延伸45分钟。   全自动毛细管电泳   取PCR扩增产物1.5 l或Ladder 1 l加入21 l上样液(去离子甲烯胺20 l +Rox500内标1.0 l), 95变性5分钟后立即冰浴至少5分钟,ABI310遗传分析仪采用POP4 (Perforance

17、Optimized Polymer 4)胶及36 cm长毛细管进行全自动毛细管电泳及片段分析。   信息分析   遗传分析仪应用Genescan 3.1软件,根据Rox500内标准确计算出DNA扩增片段碱基长度,读出峰下面积值，并应用Genotype 2.1软件,根据DNA片段长度及等位基因梯Ladder阅读各位点的基因型。   计算嵌合率   根据供受者基因型的差异,选择嵌合体计算公式5，代入峰下面积值,计算供者细胞嵌合百分率（DC）,供者细胞嵌合率取所有信息位点DC的均值。   统计学处理&

18、#160;  应用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析。   结   果   STR信息位点的选择   我们选择Profiler Plus的9个STR位点均为4个碱基串联重复序列,加上1个性别位点,共10个位点。Cofiler Plus的6个STR位点也是4个碱基串联重复序列,加上1个性别位点,共7个位点。27对供受者中能区分出彼此差别的平均STR位点数为Profiler Plus 6.3(4-9)个, Cofiler Plus有4.9(2-6)个,非亲缘供者Profiler Plus为7.8 (7-

19、9)个, Cofiler Plus为5.5(5-6)个；在亲缘供者中Profiler Plus为6.5(4-9)个，Cofiler Plus为4.4(2-6)个。            用两种试剂盒扩增STRPCR方法检测DC嵌合率的结果比较   对11例移植患者同时应用Profiler Plus和Cofiler Plus两个试剂盒扩增STRPCR进行DC检测,两种扩增试剂盒的结果具有较好的一致性。附图显示1例接受两种试剂盒扩增患者移植后6个不同时间点DC结果。 &

20、#160; 移植后28天嵌合体的检测   27例患者在移植后28天的骨髓STRPCR嵌合体检测结果显示: 移植后28天完全嵌合(complete chi merism, CC)26例,混合嵌合(mixed chimerism, MC)1例。18例持续CC中,目前存活14例且仍保持完全缓解状态,死亡4例。死亡病人中1例在移植后280天死于间质性肺炎,1例在移植后60天死于脑出血，1例在移植后120天死于肝衰竭，1例在3次输注供者外周干细胞后，于120天时死于弥漫性血管内凝血，但上述患者死亡时嵌合体仍为100%供者型嵌合。9例MC中1例在移植后28天死于没有植入；8例分别在移植

21、后不同时间呈现MC和CC，其中1例在移植后60天转为完全受者型后死亡。   MC患者的嵌合体动态监测   结果见附表。从附表中可以看出，例1患者嵌合体的比例随时间不断下降,在移植后180天嵌合体比例为90.2%,考虑可能早期复发，遂住院治疗，于210、270天查DC又下降，经骨髓像检测确为血液学复发，目前该患者在进一步治疗中。例6患者在移植后28天为100%供者型嵌合，但在60天时DC下降为51.4%,此时骨髓中原始细胞占5%，bcrabl融合基因阳性，为本病复发。随着时间推移DC呈下降趋势，在98天时给予供者淋巴细胞输注，19天后嵌合体为47%，目前嵌

22、合体和融合基因仍在动态检测中。病例2、5、8、9  CML病人各在移植后不同时间出现混合嵌合状态，但通过临床干预治疗又恢复到完全嵌合，现继续对这些病人保持动态检测。例7在90天时出现血液学复发，120天时嵌合率继续下降，但目前患者已放弃治疗。例3患者嵌合体在移植后60天由原先的100%供者型转变为100%受者型嵌合，并在几天后死于本病复发。例4患者在28天时即为受者型，没有出现供者成分，在40天左右死于没有植入。   移植物抗宿主病(GVHD)的发生   27例患者中仅1例发生度急性GVHD，后又转为慢性GVHD。在CC组中慢性GVHD的发生率

23、为44.4%，高于MC组(为22.2%),这证明了MC患者可能不会出现严重的急性GVHD或慢性GVHD，这与文献报道一致6。   免疫抑制剂的调整对嵌合状态及临床转归的影响   5例CML慢性期患者在移植后不同时间出现过MC，其中例8患者为分子生物学复发，出现一过性MC，快速减少环孢菌素A(CsA)用量,1月后由MC转为CC。其余4例CML慢性期患者接受同性别移植后出现血液学复发，RTPCR显示bcrabl mRNA阳性,例2和例9患者也在快速减少环孢菌素A(CsA)用量或停用后，1月余由MC转为CC，bcrabl mRNA转为阴性,目前仍处于持续分子生

24、物学缓解状态；另外2例患者仍持续为MC。   讨   论   多年来,已有多种植入状态分析方法应用于临床，如红细胞血型系统、白细胞抗原系统以及细胞遗传学的染色体分析等，但由于这些方法程度不同地存在着敏感性差，需要的样本量大，费时长，操作复杂，同性别不能检测等局限,目前已逐渐被DNA分析技术所取代。利用短串联重复序列(STR)结合PCR的方法被认为是目前检测移植嵌合状态最灵敏的方法之一7。荧光标记的STRPCR结合毛细管电泳与银染法相比，无论从灵敏度、准确性和所需摸板量等方面均具明显优势，而且该方法不需提前筛选供受者间的信息位点，而是同时对移植后样品、移植前样品进行PCR、电泳，同时进行数据分析，这就使嵌合体的检测更加快速、准确，同时也节省了大量的人力、物力8。本研究中我们将复合扩增荧光标记STRPCR结合全自动毛细管电泳方法成功地应用于27例接受alloHSCT患者的术后随访,应用该方法对所有患者均能找到彼此可区分的STR位点,Profiler Plus 为6.3(4-9)个, Cofiler Plus为4.9(2-6)个, 非亲缘供者Profiler Plus为7.8 (7-9)个, Cofiler Plus为5.5(5-6)个；在亲缘供者中Pro