Bim蛋白在全脑缺血再灌注损伤中的表达

1、Bim蛋白在全脑缺血再灌注损伤中的表达（中国医科大学附属盛京医院 1麻醉科 2妇产科 沈阳 辽宁 110004）陈宏志1，王光伟2,陈卫民1摘要：目的 探讨大鼠全脑缺血再灌注与Bcl-2 相互作用的细胞死亡调解子(Bim)蛋白表达的变化。方法 构建大鼠全脑缺血再灌注模型，采用TUNEL法原位检测凋亡锥体细胞，免疫印迹检测不同实验组中Bim蛋白表达。结果 缺血再灌注各组神经元细胞的凋亡率明显高于假手术组 (P <0.05)。缺血再灌注组Bim蛋白表达积分光密度值与假手术组相比有显著差异(P <0.05) ，于第2h达到高峰,之后逐渐降低。结论 在脑缺血及在灌注损伤中存在有Bim途径的

2、过度激活，导致Bim蛋白表达增加，进而导致神经元细胞的凋亡明显增加。关键词：全脑缺血再灌注损伤，凋亡，BimExpression of jenes Bim signaling transduction pathway in rat brain follwing cerebral ischemiaCHEN Hong-zhi1,WANG Guang-wei, CHEN Wei-min1(1Department of Anesthesia, 2 .Department of Obstetrics and Gynecology. )Abstract:ObjectiveTo study the Bim

3、pathway in cerebral ischemia reperfusion lesion.Methods To construct the model of rat cerebral ischemia reperfusion lesion, collect the tissues of dentate gyrus of rats and make coronal sections, observe the number of apoptosis cells in hippocampus under light microscope. To examine the apoptotic py

4、ramidal neuron by TUNEL test and the expression of Bim in different groups by immuno- blotting test.Results The apoptosis rate and the necrosis rate in ischemia reperfusion groups are significantly higher than that of control(P<0.05), The expression of Bim in ischemia reperfusion groups was diffe

5、rent to that of control(P<0.05), and increased with the elongation of the time of reperfusion, peaked in 2h, then decreased gradually. Conclusions The expression of Bim was over activated during the cerebral ischemia and the reperfusion lesion, the expression of Bim was increased，then the number

6、of apoptosis cells was increased. KEY WORDS: cerebral ischemia reperfusion lesion, apoptosis, Bim.脑缺血是常见的病理过程,严重影响着人类的健康和生命。造成脑缺血的原因主要有两个方面14,一是脑动脉管腔的狭窄或闭塞造成该动脉所支配的区域脑组织缺血。二是由于体循环障碍如低血压、心脏骤停、失血性休克等原因引起的全脑的缺血。由于脑的不同部位和不同细胞对缺血的敏感性不同,缺血所致的损伤也不同。大脑较脑干各级中枢更为敏感,大脑皮质较白质敏感。目前认为脑缺血损伤涉及到自由基、能量耗竭、兴奋性氨基酸、钙超载等问题

7、,与一氧化氮、内皮素、细胞凋亡等关系密切5,6。随着神经分子生物学和免疫学等技术的发展,发现许多分子介导了缺血性脑损伤, 近年来的研究表明抑癌基因Bim与脑缺血损伤有关，在凋亡刺激因子的作用下，Bim从微管释放引起casepase参与细胞凋亡，但具体方式目前仍不清楚7，有报道慢性粒细胞白血病急变时Bim表达也较对照组明显降低，格列卫（Imatinib）可诱导Bim表达，从而引起细胞凋亡8，但脑神经组织细胞凋亡与Bim表达关系尚少见报道，本实验就大鼠全脑缺血时细胞凋亡与Bim的关系进行探讨。1 材料与方法1.1试验试剂： 鼠抗人Bim单克隆抗体。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG；Ecl发光试剂（

8、Santa Cruz公司）原位检测凋亡锥体细胞（德国IN SITU CELL DETECTION KIT）POD试剂盒1.2 实验动物模型制备Wistar大鼠54只，雄性，体重300±20g，由中国医科大学动物部提供。22-25伺养1d以适应环境，实验前夜禁食不禁水。采用10%水合氯醛0.3ml/kg 进行腹腔麻醉并用灯光加热保持体温于36.5-37.2，体温监测采用动物鼓膜测温法，实验过程保持室内灯光及周围环境一致。54只大鼠随机分成6组，每组9只大鼠。对照组，即假手术组(SH)：背位暴露锥间孔，不处理缝合，俯位颈部正中切开，剥离暴露双侧颈总动脉后不夹闭血管，缝合，去脑处死；缺血后

9、按再灌注时间分为5组，每组9只，分别再灌注30min（IR组），2h(IR组)，12h(IR组)，24h(IR组 )，48h（IR组）。背位暴露锥间孔，直接用41/2号注射器针头捣毁椎动脉，再使用电灼器直接电灼注射器针头后缝合。无损伤动脉夹同时夹闭双侧颈总动脉5min，松开双侧颈总动脉动脉夹，分别再灌注30min、2h、12h、24h、48h后处死断头取脑海马组织，一部置-70保存，另一部置于4%福尔马林固定3d，石蜡包埋切片。1.3 组织病理学检查于海马齿状回平面4m厚连续冠状切片，光镜(×200)下观察海马细胞凋亡数。采用TUNEL法(荧光标记的终末脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP

10、缺口末端标记法)原位检测凋亡锥体细胞，按凋亡试剂盒所示步骤进行染色，二氨基联苯胺(DAB)显色，封固，观察。胞浆中见棕褐色颗粒为阳性，见图1（a、b）。1.4免疫印迹检测不同实验组Bim蛋白表达量。取-70保存的脑组织约0.2g，剪碎，加入冰浴裂解液1ml。离心后取上清，考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。将40g总蛋白上样、电泳2h后转膜、封闭。分别加入鼠抗人Bim单克隆抗体及二抗，室温孵育1h，加入ECL发光试剂，反应1min后在暗盒内加X光片曝光1min，显影5min，定影5min。应用自动电泳凝胶成像分析仪分析蛋白条带的强弱，蛋白表达水平以积分光密度值表示。1.5 统计学处理 病理组织学观察由

11、3名有经验人员在光镜（×200）下随机观察缺血周围5个不重叠的视野，每个视野不少于100个细胞，计数阳性细胞数，取其平均数，采用SPSS11.0统计软件，采用以均数±标准差（x±s）表示，组间以方差分析后最小显著差(LSD)检验，P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 组织病理学检查缺血再灌注后神经元细胞凋亡情况缺血再灌注各组神经元细胞的凋亡率明显高于SH组，有显著差异(P <0.05), 海马神经元可见到有细胞凋亡的表达,并随再灌注时间延长逐渐增高,于第2h达到高峰,之后逐渐降低, 但缺血再灌注IR组和IR组间比较无显著性差异(P >0.05)

12、。见表1。表1. 脑缺血再灌注后凋亡细胞阳性数表达观察（个/视野,n=9, x±s）分组N凋亡细胞阳性数目对照组96.22±1.39IR910.44±2.01*IR931.33±3.00*IR939.89±2.57*IR920.00±2.78*IR917.89±2.20*注：*表示与其他组比较p0.05，表示与前一组比较p0.052.2 缺血再灌注后Bim蛋白的表达情况缺血再灌注IR组和IR组Bim蛋白表达积分光密度值明显增加，与SH组相比有显著差异(P <0.05),并随再灌注时间延长逐渐增高,于第2h达到高峰,之后

13、逐渐降低，但缺血再灌注IR组和IR组间比较无显著性差异(P 0.05)，于再灌流24h后Bim蛋白表达积分光密度值与SH组相比明显减少，有显著差异(P <0.05)。见表2。表2. 大鼠脑海马组织免疫印迹检测不同实验组Bim蛋白表达分 组N蛋白表达积分光密度值（IDV）Bim蛋白SH组9 63.57±5.63IR9 37.54±7.18*IR9107.13±9.05*IR9 104.64±10.95*IR9 36.85±4.45*IR9 34.98±3.61*表示与对照组比较p<0.05，表示与其他组相比p<0.05

14、，表示与前一组相比P<0.05。3 讨论脑缺血性损伤的机制和防治一直是该领域研究的热点，血管阻断所导致的急性脑缺血需要迅速的血管再通，而脑血流的重新灌注会导致再灌注损伤。为了更好的保护组织，抑制再灌注损伤很重要。由于海马区神经元对缺血具有选择性敏感,短暂性脑缺血即可导致该区神经元的迟发性死亡,所以海马区成为缺血性脑损伤研究的一个典型脑区。随着研究的深入,人们发现短暂脑缺血后海马区出现神经元的死亡与细胞凋亡密切相关,有学者认为短暂脑缺血后海马区神经元出现的迟发性死亡是细胞凋亡的过程。Bim定位于7p15.2，编码含129个氨基酸的蛋白质，属于Bcl-2家族，仅含有Bcl-2家族4个同源结构

15、域（BH1-4; Bcl-2 homology domains）中的BH3域，因此被称为“仅含BH3域蛋白” (BH3 only proteins)，是仅含BH3域的的Bcl-2家族成员。在线粒体Bim也可被Bcl-2家族中的Mcl-1,Bcl-Xl等抗凋亡分子扑获，从这类抗凋亡蛋白中释放出来也是Bim诱发凋亡的重要机制之一9。检测细胞凋亡的方法很多,其中TUNEL法具有检测快,特异性强,灵敏度高,可以原位检测细胞凋亡等优点,所以本实验采用TUNEL法检测细胞凋亡。本实验结果提示，缺血再灌注各组神经元细胞的凋亡率明显高于SH组，有显著差异(P<0.05), 海马神经元可见到有细胞凋亡的表

16、达,并随再灌注时间延长逐渐增高,于第2h达到高峰,之后逐渐降低, 24h后细胞凋亡趋于平稳。Zhang等10发现大鼠局灶性脑缺血2h,再灌注46h细胞凋亡达高峰。我们的结果与其报道不同,其原因可能与我们采用的全脑缺血再灌注大鼠,从而影响了一些基因表达的差异,继而对凋亡细胞产生影响有关,或与两者缺血再灌注损伤的严重性不一致等有关。本实验缺血再灌注IR组和IR组Bim蛋白表达积分光密度值明显增加，与SH组相比有显著差异(P<0.05),并随再灌注时间延长逐渐增高,于第2h达到高峰,24h之后逐渐降低，提示Bim途径在脑缺血时被过度激活；随着Bim的蛋白表达上调，同时期缺血再灌注各组神经元细胞

17、的凋亡率明显高于SH组，并随再灌注时间延长逐渐增高, 于第12h达到高峰,之后逐渐降低,提示在神经元中依赖的细胞凋亡过程中，Bim是重要参与者， Bim蛋白表达上调，进而诱导神经元细胞发生凋亡。-淀粉样蛋白诱导老年性痴呆神经退行性病变之前，也有Bim蛋白表达增高11，确切地理解Bim蛋白在缺血再灌注性神经细胞死亡中的作用具有重要的临床意义,将给脑损伤的治疗带来崭新的启示。参 考 文 献1 Roux PP, Blenis J. ERK and p38 MAPK-activated protein kinases: a family of protein kinases with diverse

18、biological functionsJ.Microbiol Mol Biol Rev. 2004 ;68(2):320-344.2 Fanger GR. Regulation of the MAPK family members: role of subcellular localization and architectural organizationJ.Histol Histopathol. 1999; 14(3):887-894.3 Putcha GV,Oulder KL,Golden JP, et al. Induction of Bim,a proapoptotic BH3-o

19、nly Bcl-2 family member,is critical neural apoptosisJ.Neuron, 2001,29:615-628.4 Bouillet P, Strasser A. BH3-only proteins-evolutionarily conserved pro-apoptotic Bcl-2 family members essential for initiating programmed cell deathJ. J Cell Science.2002,115(Pt 8):1567-1574. 5 陈宏志，高光洁. 预吸氧、缺氧和复氧时大鼠脑组织iN

20、OS表达变化的研究J中国医科大学学报2006,35(3):239-241.6 Yang GY,Schielke GP,Gong C,et al.Expression of TNF- and ICAM after focal cerebral ischemia in IL- converting enzyme deficient mice. J Cereb Blood Flow Metab,1999,19:1109.7 Sandalova E,Wei Ch,Masucci MG,et al Regulation of expression of Bcl-2 protein family member Bim by T cell receptor triggering Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(9):3011-3016.8 Kuribara R,Honda H,Matsui H,et al Bim is a suppressor of Myc-induced mouse B cell leukemia Proc Natl Acad S