在低氮胁迫下水稻剑叶基因转录因子表达的变化

1、在低氮胁迫下水稻剑叶基因转录因子表达的变化 摘要:对低氮胁迫的转录因子基因反应的研究,为提高氮肥在水稻 的吸收和利用效率提供分子基础。 安捷伦水稻基因组芯片被用来研究 了在低氮胁迫下两个水稻品种(SN 196和 Toyonishhiki 转录因 子基因表达的变化与叶绿素含量含量的变化。 结果表明, 在低氮胁迫 下超绿水稻品种 SN196剑叶共有 53个转录因子基因(35个下调, 18上调至基因转录水平上,在 Toyonishiki 品种剑叶中 27转录因 子基因(21个下调, 6个上调至基因转录水平 。在这些氮反应基因 中, SN196品种中 48个转录因子基因和在 Toyonishiki 中

2、 22个转录 因子基因变化显著。低氮胁迫下 SN196和 Toyonishiki 之间,有重 叠的转录因子基因响应。 , 1上调和 4个下调至转录水平。在两个水稻 品种之间低氮反应染色体的基因分布是不同的。水稻是中国种植面积最大,产量最高利用氮肥最多的粮食作物 之一。 2002年,水稻在中国种植面积达到 2.85×107hm2,占世界 水稻种植总面积在的 20%,但在中国水稻种植区使用氮肥的量比世 界平均水平多 30%。大量氮肥的应用降低肥料的利用率,造成了能 源的极大浪费, 增加了食品成本, 严重影响了农民生产粮食的积极性, 更重要的是, 造成严重的环境污染。 因此, 如何提高水稻

3、的氮素吸收 效率, 减少氮肥的施用量, 同时仍保持高产稳产是近年来研究的热点 (美, 1997; Inthapanya等, 2000; Koutroubas和 Ntanos , 2003年问题。植物转录因子在植物生命活动起着重要作用。由于首次在玉米中发现, 之后就有数以百计的植物转录因子被发现, 并在水稻至少有 2 300转录因子,在水稻生长和发展中起着重要作用。以往的研究结 果表明, 通过一系列的应激相关基因 (Jaglo -的 Ottosen 等, 1998 ;春日等, 1999 ;筱崎等人, 2000 ;陈等人, 2002的调整,植物转 录因子影响了植物胁迫耐受性。 到目前为止, 已知的

4、转录因子与一系 列抗逆基因,对抗低温,干旱,盐和疾病(Maleck 等密切相关, 2000 ;参数在线等, 2001 ; Singhet人, 2002年 ; Aharoni等, 2004 ;陈等人, 2004; 金, 2006 ;廉等人, 2006 ; Zhao等, 2011 。利 用全球基因组表达芯片分析,廉等人(2006表明,在低氮胁迫, 在水稻根系发生变化 11转录因子中有 5个上调基因和 6个下调基因, 这就说明转录因子表达水平也与低氮胁迫密切相关。 然而, 这些结果 只限于在低氮胁迫下苗期水稻。 据悉, 水稻叶片叶绿素含量与氮供应 密切相关(武罗, 1996; Li等人, 2003

5、。因此,氮限制条件下, 叶绿素含量的差异反映氮素吸收效率和叶绿素合成的差异。 本研究利 用水稻基因芯片技术研究水稻在抽穗期剑叶中转录因子的氮胁迫响 应差异和叶绿素含量, 以便更好地了解作物对低氮胁迫的反应及其机 制,并为提高水稻氮肥吸收和利用效率提供参考。材料与方法超绿水稻 SN196,是沈阳农业大学水稻研究所超级稻育种实践中发 现的一叶色突变体。 经过几年的不断自我繁殖, 性状稳定表现特点为 深绿色色,生长过程中叶片中具有高叶绿素含量。 Toyonishhiki 是 一个普遍的日水稻品种,其叶绿素含量显著低于 SN196。这两种材料的相关特性已经被研究过了(Sui 等, 2010 。材料的培

6、养该实验的实验基地在沈阳农业大学,中国水稻研究所。水稻种 植在 30厘米的开口直径的塑料盆内,在 20厘米的直径,且为 26厘米 的高度。每盆含 13.5千克土壤且充分混合,过筛,干燥。土壤为砂质 壤土为 29.8毫克 /克有机质含量, 总氮含量 1.11-1 .28毫克 /克。总 p 含量为 2.80毫克 /克, 总 K 含量为 34.0mg /克, 水解氮含量 30.0微克 /克,和速效磷含量 5.90微克 /克。尿素 CO(NH 2 2,氮含量: 46.7 %被用作氮肥。低氮胁迫处理被定为 N0 (0克 /千克 。正 常氮肥处理设置为 N1(0.15克 /千克作为对照。过磷酸钙 Ca(H

7、 2 PO 4 2 ·H 2 O ,磷含量:18%作为磷的肥料和 KCl 作为钾 的肥料。 为了避免在同一时间过度使用氮肥, 损害稻秧, 氮肥施在三 次:底肥(50 % ,分蘖肥(30 %和穗肥(20 % 。 磷, 钾肥分别为基肥施一次。 幼苗生长在绝缘和干燥的土壤养分 (苗 特有的土壤,根据生长方式和水稻幼苗的营养特点准备 。稻苗在 4叶期移栽到准备好的塑料盆中。每盆有 3个孔,每个孔有 1幼苗,每 个样品重复 3次。植物覆盖避雨,以防雨水和氮肥的损失。其他管理 人员均同于一般的生产领域。剑叶收集在抽穗期,液氮速冻 ,并储 存于 -80 ,以备使用。相对叶绿素含量,叶片含氮量的测量

8、使用叶绿素含量计(CCM-200, OPTI-科学,美国对在抽穗期 剑叶中主茎的相对叶绿素含量进行了测量。在每个盆中收集三片叶子,分别测定每片叶子的上部,中部和下部。每个处理重复 3次。将 抽穗期的剑叶分别放在在 105ºC 烘箱中固定 30分钟,在 80干燥至 恒重,然后研磨。半克样品(精确至 0.0002g 克置于消化管和浸在 1毫升水中。硫酸钾(7克和硫酸铜·5H2O (0.8 G 加入在消化 管与催化剂 12毫升的浓硫酸,并充分混合。样品被消化的消化烘箱 中于 420维持 60-90分钟,直到溶液变得透明的蓝绿色的颜色。冷 却 10-20分 钟 后 , 叶 片 含

9、氮 量 是 用 一 个 自 由 和 开 放 源 码 的 Kjeltec2300分析仪组(福斯 AB ,瑞典测定。提取和纯化的总 RNA按照 Trizol 试剂(Invitrogen 公司,美国的说明提取 RNA 和使用 RNeasy mini试剂盒(Qiagen 公司,荷兰进行 RNA 的纯 化。纯化的 RNA 样品 A260and A280值是使用 UV 分光光度计(日 立公司,日本进行测定。根据测得的浓度,每个 RNA 样品稀释到 相同浓度下, 和 1 g RNA是由 0.8%变性琼脂糖凝胶电泳检测到。 RNA 样品从 3生物重复进行等体积混合,并用于微阵列分析。水稻基因芯片为 '

10、0' 的平均表达值和背景的调整, 以增加信噪比。 多余数据, 进行删 除,以提高加工效率和使结果更容易理解。这两个品种的 N1处理作 为对照,通过 N0处理并对表达水平进行了比较, 表达水平超过 2倍的变 化被认为是基因表达改变的阈值。实时定量 PCR 分析将每一 RNA 样本三个重复反转录成 cDNA , 然后进行实时定量 PCR 分析, 将反转录的 cDNA 作为模板, 使用来自 Qiagen 公司在 ABI7500荧光定量 PCR 仪中的 SYBR Green RT-PCR 检测试剂盒中 水稻肌动蛋白 作为 内部参考。 在超级绿色水稻 SN196微阵列分析中有四个基因的 差异表达

11、中随机选取,使用设计的引物表达 3.0软件(表 1 ,以验 证基因芯片分析结果的引物进行实时荧光定量 PCR 分析。从每个样 品中每个基因重复四次并用相对定量法进行定量计算。 计算公式为靶 基因的相对定量是相对。 EXP = 2 - Ct 法,其中 Ct 法 = Ctunknown 样品 - Ctcalibrator , Ctunknown 样品 = Ctinternal 参 照 基 因 - Cttarget 基 因 , Ctcalibrator = Ctreference 基因的参考样本 - Cttarget基因的参考样本 .结果:表 1中。引物为肌动蛋白的实时定量 PCR 和四个随机选择的

12、基因的差异 表达在超级稻绿 SN196微阵列分析。1. 在低氮胁迫水稻剑叶叶绿素和氮含量表二表明,在低氮胁迫下这两个品种中相对叶绿素含量和氮含量较 对照水平下都明显降低, SN196和 Toyonishiki 中相对叶绿素含量 分别降低 22%和 41%达到显著水平,而相对氮含量分别降低 21%和 41%也达到显著水平。通过这两个品种之间比较,超绿 SN196剑叶中叶绿素和氮含量明显高于 Toyonishiki 。2. 低氮胁迫下水稻剑叶相对转录因子基因与对照组相比,在低氮胁迫下 SN196剑叶中有 53个转录因子的 表达发生了变化, 其中, 35个基因下调 ,3.6倍的变化, 18个基因上调

13、, 2.8倍的变化。 Toyonishiki 剑叶中有 27个转录因子的表达发生了变 化。其中 21个基因下调在 2.0-5.4倍之间平均 2.7。 6个基因上调在 2。 3到 13.6倍之间,平均 4.2倍的升高。3. 低氮胁迫下在水稻不同叶绿素含量的品种特异性反应和重叠的转 录因子基因在低氮胁迫下, 水稻不同叶绿素含量的最低氮肥胁迫响应转录因 子曾在转录水平发生特异性改变。在 SN196剑叶中的 53个低氮肥胁 迫响应转录因子中 48个发生特异性改变,达到 90.6%.在这 48个中, 17个上调, 31个下调到转录水平。 Toyonishiki 剑叶中的 22个低氮肥 胁迫响应转录因子发

14、生特异性改变,达到 78.6%.在这 22个中,有 17个转录抑制其中 5个是在低氮胁迫下。在低氮胁迫 下在 SN196和 Toyonishiki 有含有 5个相同的低氮胁迫响应转录因子, 其中 4个表达 下调 1个上调。4. 低氮胁迫响应转录因子和其他一些转录因子的分类表 4和 5中表明, 低氮胁迫下含有高叶绿素的 SN196转录过程中 有 53个转录因子发生变化。他们属于 14转录因子家族。 MYB 家族含 有最多的上调转录因子,其中 Os07g0443500达到最高上调水平。 WRKY 家族含有最多下调转录因子,其中 AK106282达到最高下调水平。有一些家族同时含有上调和下调转录因子

15、。例如 bHLH 家族 中当其他基因下调的时候 AK073183上调。 WRKY 家族中当其他基 因下调的时候 AK109770上调。 MYB 同时含有上调和下调基因。在 Toyonishiki 中有 8个转录因子家族的转录因子表达发生变化。 MYB 中的 Os07g0443500达到最高上调水平 bHLH 和 MYB 家族同时含 有上调和下调基因。5. 低氮胁迫响应转录因子中染色体分布在 SN196中低氮胁迫响应转录因子主要分布在 1,2,3,4,5,6和第 8条染色体上,第 3条染色体上含有最多的低氮胁迫响应转录因子基 因。第 4条染色体上含有 9个。在第 2和 7和 11条染色体上仅含有

16、一个 转录因子。在第 9,10,12条染色体上没有发现改变的转录因子。 在 Toyonishiki 中低氮胁迫响应转录因子主要分布在 1,2, 3条 染色体上,主要的转录因子分布在第 3条染色体上, (9个属于 4个 转录因子家族。其次就是第 1条染色体上(6个 ,他们属于 2个转录 因子家族。在第 8和第 10条染色体上没有转录因子表达的变化。 在这两个品种有四个相同的转录因子表达量降低, 3个在第 3条 染色体上,一个在第 11条染色体上。在这两个品种中有一个相同的 转录因子表达量升高。在第 7条染色体上。6. 实时定量 PCR 分析为了验证微阵列数据的准确性,在 SN196中表达变化的基

17、因中 随机选择 4个,设计引物进行实时定量 PCR 分析, PCR 反应后,对 熔解曲线进行分析。溶解曲线呈单峰,表明每一个 PCR 产物要有优异的特异性来保证后续结果的可靠性。表明,通过实时定量 PCR 分 析基因 1和基因 2的表达变化倍数略高于微阵列分析。在基因 3和基因 4中实时定量 PCR 分析的表达变化倍数略低于微阵列分析。从这四 个表达变化的基因, 实时荧光定量分析的结果基本上是与该微阵列分 析结果基本一致,表明该微阵列分析是可靠的。讨论转录因子在植物抗逆中起着重要的作用。在不同的胁迫条件下, 许多转录因子的转录水平例如 AP2/EREBP, bZIP/HD-ZIP和 MYB 既

18、能诱导又能抑制。 特异性转录因子在转录水平的改变可以大大的影 响植物适应环境胁迫的能力。 连等人应用全球基因表达微阵列分析在 低氮胁迫下苗期的基因表达水平发现 5个转录因子上调, 6个下调。 本研究表明长期低氮胁迫可以诱导或抑制转录因子的表达, 大多数表 达变化的转录因子在转录水平上具有品种特异性表达, 且具有不同的 叶绿色含量。 在 SN196和 Toyonishiki 分别有 90.6%和 78.6%的氮胁 迫转录因子。 在这两个品种间不同叶绿素含量的品种特异性反应表明 低氮胁迫在转录水平上的差异。 正因为有很多转录因子且调控的多样 性, 就不难理解在低氮胁迫下这两个品种相同的转录因子表达

19、的差异 性。 表达差异可能是由于增强植物某些物质生物活性生理生化活动的 再组织与调节,抑制表达的其他物质主要是来适应低氮胁迫降低损 失。 在低氮胁迫下这两个品种重叠转录因子的表达表明这两个品种有 些共享的反应机制。根据已完成的水稻基因组序列数据的生物信息学分析表明,水稻含有 184个 bHLH 基因,组成了水稻最大转录因子家族。水稻的 bHLH 基因家族具有广泛的生物学功能, 例如生长和发育的调控, 营 养吸收和信号传导。水稻的 bHLH 基因家族成员参与植物生长发育 过程的各个阶段,然而,只有少数植物 bHLH 结构基因已被克隆, 并明确了其详细的生物学功能。李等人对水稻 bHLH 基因家族成员 的表达模式进行了详细的研究,表明大量的 bHLH 基因组成性表达, 具有组织,空间特异性。连等人还发现一些 bHLH 基因家族的表达 在低氮胁胁迫下苗期的根组织中表达变化。 在本研究中, 也表明一些 bHLH 基因也参与环境胁迫反应的分子调控。在低氮胁迫下一些 bHLH 基因表达上调一些表达抑制, 表明不同的基因响应环境胁迫用 不同的方法。表达变化的 bHLH 基因家族成员在这两个品种之间不 同。有 4个响应 bHLH 基因在 SN196, 2个在 Toyonishiki ,表明抵 抗低氮胁迫的不同