发酵豆粕脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原的测定研究

1、发酵豆粕脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、凝集素 和大豆抗原的测定研究彭辉才1粱明振1张宏福2(1广西大学动物科技学院,广西南宁530005;2北京畜牧兽医研究所营养学国家重点实验室, 北京海淀区100094摘要:豆粕中最主要的抗营养因子是胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原;本试验对8种发酵豆 粕进行测定,前两者含量极低未检出。用SDS-PAGE凝胶电泳定性检测大豆抗原中的B一伴大豆球蛋 白(B-Conglycinin和大豆球蛋白(Glycinin,6种条带模糊,抗原消失,结果表明,生物发酵是 一种有效的钝化抗营养因子的方法。关健词:胰蛋白酶抑制因子凝集素13一伴大豆球蛋白大豆球蛋白测定发酵豆粕指是

2、通过现代生物发酵技术对原料豆粕进行发酵处理后的产物。发酵过程中可产生蛋 白酶、非淀粉多糖酶和植酸酶等多种酶活,其目的就是消除抗营养因子,把大分子量的大豆蛋白质 分解为多肽、寡肽、小肽,从而增加水溶性,提高消化率,利于动物消化吸收。这些酶把纤维类物 质分解为糖,部分糖被转化为乳酸,并产生大量有益微生物,使豆粕转化成高营养价值的功能性饲 料。发酵豆柏可替代日粮中血浆蛋白粉、鱼粉、肠膜蛋白和乳清粉等动物性饲料原料,可替代日粮 中控制腹泻的预防性抗生素,大大降低生产成本,减少畜禽养殖对动物性饲料原料的依赖,杜绝动 物性饲料原料所带来的疾病传播,提高养殖业的安全与效益。大豆的抗营养因子有蛋白酶抑制因子(

3、protease inhibitors,大豆凝集素(SBA、大豆抗原、 非淀粉多糖(NSP、植酸(phytic acid、单宁、大豆寡糖、脲酶、.大豆异黄酮、大豆皂甙、致甲 状腺肿因子、生氰糖甙等。这些抗营养因子会导致人和动物胰腺肿大、过敏反应、生长缓慢、日粮 养分利用率下降以及其他一些不良生理反应。本试验测定起主要抗营养作用的胰蛋白酶抑制因子、 凝集素及大豆抗原中的大豆球蛋白和B一伴大豆球蛋白。1材料与方法1.1腮酶的测定脲酶活性测定参照国标GB8622-88执行。1.2胰蛋白酶抑制因子(TI的测定方法发酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子的测定,参照中华人民共和国农业行业标准NY/T1103.2-20

4、06, 转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第2部分:胰蛋白酶抑制剂的测定。其原理是,胰蛋白 酶可作用于底物苯甲酰一L-精氨酸对硝基苯胺(队PA结构中精氨酸与对硝基苯胺的连接键,释放出 黄色的对硝基苯胺,该物质在410hm有最大吸收值。大豆及其产品中的胰蛋白酶抑制剂可抑制这一反应,使吸光度 值下降,其下降程度与胰蛋白酶抑制剂活性成正比。用分光光度法在410hm处测定吸光度值的变化, 可对胰蛋白酶抑制剂活性进行定量分析。1.3凝集素的测定方法发酵豆粕凝集素的测定,参照戴大章<饲料中植物凝集素的快速检测方法>中的方法进行,其原 理是,凝集素具有凝集兔、人等的红细胞的能力,细胞凝集作用

5、是凝集索与细胞表面的糖分子结合 在细胞表面形成许多交叉的“桥”的结果。凝集活力(效价与凝集素的量成线性关系。因此,利用 凝血反应测定其血凝活力,通过比较标准品与待测样品的血凝活力,可以定量检测凝集素含量。 1.4B一伴大豆球蛋白(BCongIycinin和大豆球蛋白(Glycinin测定方法B-Conglycinin,目前多数人认为这是相对分子量为180kDa的三聚体,是7S的主要组分,由 三个亚基(a 7、0、B组成。可用SDS-PAGE凝胶电泳使其变性,从而将其单体亚基分开。大豆球 蛋白(Glycinin,是纯化的11S大豆球蛋白,目前认为其是相对分子量为360kDa的六聚体,其单聚 体亚

6、基的结构为A-S-S-B,A和B都是酸性多肽,但分子量不同,S-S为二硫键,将A和B连接起来。 B一巯基乙醇(B一脏等还原剂可将Glycinin的亚基和多肽分开幢1。测定这两者的方法是,用 Tris-HCl提取,然后进行SDS-PAGE凝胶电泳,对照标准蛋白质Marker,定性检验其在发酵豆粕中 存在的情况。丙烯酰胺30%单体贮液:称取丙烯酰胺29.19,甲叉双丙烯酰胺0.99,于250mi烧杯中,向烧 杯中加入约80ml灭菌去离子水,充分搅拌溶解,加灭菌去离子水将溶液定容至lOOml,棕色瓶4度 冰箱保存。分离胶缓冲液贮液1.5M Tris-Hcl(pH8.8:称量18.169Tris置于2

7、50Inl烧杯中,加入灭菌水 约80ml,充分搅拌溶解,用6M盐酸调节pH值至8.8,将溶液定容至lOOml,4度冰箱保存。浓缩胶缓冲液贮液1.OM Tris-Hcl(pH6.8:称量12.129Tris置于250mi烧杯中,加入约80ml 灭菌水充分搅拌溶解,用6M盐酸调节pH值至6.8,将溶液定容至毫100m1.4度冰箱保存IO%SDS溶液:称量lOg SDS置于200ml烧杯中,加入lOOml灭菌水溶解,室温保存。10%过硫酸铵:称取lg过硫酸铵,加入9mi去离子水后搅拌溶解,贮存于4度冰箱中。5*Tris-Glycine Buffer(电极缓冲液:称量下列试剂于1L烧杯中:Tris 1

8、5.19,Glycine(甘 氨酸949,SDS 5.Og;加入约800ml去离子水,搅拌溶解,加去离子水将溶液定容至lL,室温保 存。样品缓冲液(0.踟Tris-Hcl,pH6.8:1.6IIIl浓缩胶缓冲液贮液(1.伽Tris-Hcl,pH6.8,4ml IO%SDS,Iml 8一巯基乙醇,2.5ml甘油,0.19溴酚蓝,转移到20ML容量瓶,加去离子水定容到刻度。 染色液:称取0.59考马斯亮兰P,250,加125mi异丙醇溶解,加50ml冰醋酸搅拌均匀,再加325mi去离子水搅拌,然后用快谜定性滤纸过滤.室温保存。脱色液:取50ml冰醋酸,25ral无水乙醇,42钿1去离子永,混合均匀

9、,室温保存。I t3不连墟￥OS-P性黜电泳的浓缩腔和分离腔的材取按下表比例配制分离腔与浓缩胶表l 1羁升高睨和鼹浓缩胶配制144电泳将提取液与样品缓冲液以i:l的比例混台后,在100度水浴锅中煮5min取30u1,点样到制作 好的电泳板上。虽白质Marker的用量参照其说明书.内外均加一样的电极缓冲瘦,开始以80V电 压电泳,持溴酚蓝条带进入分离脞后,加大电压到120V,溴酚蓝到底部上约050I处结柬电泳。 145染色、脱色和照相将电泳后的胶板移染液中.在转速为40一60r/rain的摇床上染色2h后,转到脱色液中浸泡过 夜,期间更换2-3狄脱色藏,至电林条带清晰为止。用数码相机拍摄凝胶照片

10、,记录井保存。2结果与分析2I量活性8种发酵豆粕的腮薛活性均为0。22胰蛋白一抑崩囚于和疆墓素用上述方法测定了8种发酵豆粕胰蛋白酶抑制园子及凝集素,古量粮低.均未检出23大豆抗原用8种发酵豆粕和一种普通豆粕.做了电泳,图片如下:其中条带5是普通豆粕,9是蛋白质分子量标准(Marker,其余是发酵豆粕,标准物分子量条带如图 标注所示,在一定条件下,蛋白质的分子量与电泳迁移率问的关系,可用下式表示:MW=K(10一hlgl哪=lgKbnh=KIbml式中:唧为蛋白质的分子量:K,K。为常数;b为斜率;咖为相对迁移率测量标准物各条带到加样口的距离,而得到分子量与迁移率的相关方程为:y=一1.3275

11、x+2.5002(r=0.99,从而算出7S和1IS的几个亚基的分子量如下表2,同样也把 Maruyama(1998和李德发(2003所研究的几个亚基的分子量列在表中,用以对照。表2五个亚基的分子量表从图上可见,1、3、4、6、7、8号样品,几个亚基消失,说明大豆抗原已经完全分解,2号和10号 样品,两种抗原的条带清楚,说明抗原存在,发酵不彻底。3讨论3.1腮酶活性(UA尿酶活性测定值是传统的用以鉴定豆柏加热程度的指标。尿酶本身无营养意义,但它与胰蛋白酶 抑制因子的含量接近,而且遇热变性失活的程度与胰蛋白酶抑制因子相似。在一定范围内,脲酶活 性与胰蛋白酶抑制因子的含量具有强相关性,测定脲酶活性

12、可以间接地反映胰蛋白酶抑制因子的含 量。但尿酶没有负值.它对任何过熟豆粕的最低值均显示为零,而此时胰蛋白酶抑制因子未必为零, 因此测定脲酶活性是不够的,还需要测定胰蛋白酶抑制因子才行。3.2发酵豆粕胰蛋白酶抑制因子和凝集素含量在一定的范围内,随着大豆中抗营养因子的受热钝化。大豆的营养价值得到改善。在大豆抗营 养因子中,胰蛋白酶抑制因子、脲酶和大豆凝集素是热敏性抗营养因子,对热比较敏感。常压蒸汽 处理,温度不超过100,蒸汽加热30min,胰蛋白酶抑制因子活性可降低90%。Oin(1996报道, 当生大豆通入蒸汽,120加热7.5min时,胰蛋白酶抑制因子的含量可由20.6mg/g下降到3.3m

13、g/g¨1。 秦贵信(1995报道,常压蒸汽102,20min,胰蛋白酶抑制因子下降88%,而40min则下降92%, 60min,全部消失哺1。7595加热25min才开始明显下降,95加热35min或120加热15min,其活性可以完全丧失。 目前发酵豆粕是用固体发酵方法生产,其生产工艺流程是:豆粕加水拌匀、蒸煮、接种、发酵、 后熟干燥、磨粉、包装。其中蒸煮灭菌是,在常压下、温度100左右,进行蒸煮约30min,这可以 使绝大部分胰蛋白酶抑制因子和凝集素失去活性。胰蛋白酶抑制因子本身是一种蛋白质,可以被蛋白酶水解成更简单的多肽,活性随着酶解反应 的进行,而逐步丧失。Laskows

14、ki等(1974盯1发现,胰蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶能特异性地将KTI水 解成多肽,降低其活性。杨晓泉呻1等(2001研究发现,在一定条件下,碱性内切蛋白酶(alcalase 可同时降解大豆蛋白和胰蛋白酶抑制因子,其中胰蛋白酶抑制因子可被钝化8096。Huo等旧1(1993用 五种来源于细菌和真菌的蛋白酶进行了生大豆(RS和低温膨化全脂大豆粉(LTES中的胰蛋白酶抑制 因子和凝集素的体外钝化试验,结果表明,它们都不同程度地钝化抗营养因子,其中一种来源于细 菌的蛋白酶分别钝化生大豆中62%的胰蛋白酶抑制因子和91%的糜蛋白酶抑制因子(CIA。由此可见,发酵豆粕生产过程中,消除抗营养因子源于两个方面

15、,一是蒸煮过程,二是发酵过 程。蒸煮灭菌后,值入的菌体一般是乳酸,酵母、芽孢杆菌属、曲霉菌属等,会分泌许多酶作用于 抗营养因子,从而降低其活性。这两方面共同作用,导致发酵豆粕中的胰蛋白酶抑制因子和凝集素 被分解和钝化,含量极低或被完全分解,从而检不出。3.3大豆抗原含量到20世纪末期,人们已认识到日粮抗原过敏反应是断奶后腹泻的先决条件,因此大豆抗原是 否已经分解,是决定发酵豆粕质量的是一个重要的指标。Maruyama等(1998,研究认为B一伴大豆 球蛋白是一种三聚体蛋白质,分子量范围为150200kDa,由三种亚基组成:a("-71kDa,a (-一67kDa, 和8(-50kDa

16、,所有的亚基都是N一糖基化的。由对照样品普通豆粕分子量和迁移率 方程可计算出,其三个亚基Q。、Q、B的分子量分别是72.3、68.6,52.7kDa,与Maruyama研究 结果很相近。在8种发酵豆粕的图谱中,我们可以看出2号样品有B一伴大豆球蛋白中的Q 7a两个亚基存在, 8号样品有B亚基存在,10号样品有大豆球蛋白的A、B亚基,其它样品均无这两种抗原的亚基, 也即均已在发酵中分解为多肽或更小分子量的肽。也说明发酵,能在一定程度上分解了大豆抗原。 可以尝试在断奶仔猪饲料中多使用发酵豆柏。3.4抗营养因子测定种类的确定各种抗营养因子在大豆中的含量各不相同,且抗营养作用兴有差异。总体上看,大豆蛋

17、白酶抑 制因子、凝集素和植酸等的抗营养作用较强,而抗维生素因子和皂甙等的抗营养作用较弱.有些甚 至没有抗营养作用,而主要作为生物活性物质。蛋白酶抑制因子,主要指Kunitz(库尼兹胰蛋白 酶抑制因子(KTI和鲍曼一伯g蛋白酶抑制因子(Bolmmn-Birk,BBI,前者主要在大豆中,而后者 主要在豌豆和菜豆中。Liener(1996研究报道¨硼,在生大豆对大鼠生长抑制作用方面,大豆凝集素76的贡献率为，胰蛋白酶抑制因子（）为，而其它抑制因子仅为。大量的研究表明，断 奶仔猪饲粮中的抗原引起肠道的短暂过敏反应是断奶后腹泻的决定因素。大豆中存在的抗原物质能 引起仔猪肠道过敏和损伤，进而引起

18、腹泻。已证实，引起断奶仔猪过敏反应的主要抗原是大豆球蛋 白和一伴大豆球蛋白。由此可见。只需测定这三者即可。其他的抗营养因子含量低，不构成抗营 养作用，不必测定。 小结和展望 大豆抗营养因子中胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原，抗营养作用最强，在抑制动物生长 中，凝集素贡献率是，胰蛋白酶抑制因子是。而大豆抗原中一伴大豆球蛋白和大豆球蛋白， 是引起断奶仔猪过敏反应而导致腹泻的主要抗原。 测定种发酵豆粕，脲酶活性均为，胰蛋白酶抑制因子和凝集素含量极低未检出。用用 凝胶电泳定性检测大豆抗原中的一伴大豆球蛋白（）和大豆球蛋白（），结 果表明，仅两种有抗原存在，其余均分解钝化，说明绝大部分发酵豆柏在发酵中已经完全钝化分解 了所有的主要抗营养因子。生物发酵是一种有效的钝化消除大豆抗营养因子的方法。 参考文献 戴大章饲