猪瘟病毒实时荧光定量RT_PCR检测方法的建立和初步应用

1、猪瘟病毒实时荧光定量RT PCR检测方法的建立和初步应用李军,潘艳,禤雄标,胡帅,马春霞,谢宇舟,陈泽祥,许力干,谢永平,杨威(广西兽医研究所,广西南宁 530001摘要:根据G enBank公布的猪瘟病毒基因组5 非编码区基因序列进行同源性比较分析,选择保守序列区作为扩增区域,设计1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了一个用于猪瘟病毒快速定量检测的SY BR Gr een 荧光定量RT P CR 方法。试验结果表明该方法重复性好,反应批内循环阈值差异不显著。与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型等猪源病毒无交叉反应,具有高度的特异性,而且灵敏度高,最小检出量为2 102

2、病毒基因组拷贝数。利用此方法对15例临床样本进行检测,其结果与兔体交叉免疫试验一致,表明此方法可作为猪瘟实验室快速诊断和疫情监测的一种快速、准确、简便的检测工具。关键词:猪瘟病毒;实时荧光定量RT PCR中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1671 7236(201103 0116 04猪瘟病毒(classical sw ine fev er virus,CSFV属于黄病毒科瘟病毒属,是猪的一种重要传染性疾病病原,猪是本病的唯一宿主,病猪和带毒猪是最主要的传染源,直接接触是病毒传播的主要方式。猪瘟发病特征为发病急,高热稽留和细小血管壁变性,引起全身广泛性小点出血,脾梗死,具有很高的发

3、病率和死亡率,对养猪业造成了严重的经济损失,被世界动物卫生组织列为A类传染病,是国际贸易重要检疫对象之一(Meuw issen等,1999。目前,CSFV的检测方法主要有3大类,即兔体交叉免疫试验、基于病毒抗原和抗体反应的血清学诊断方法和针对病毒核酸检测的PCR技术(梁仕岩等,2009。兔体交叉免疫试验和血清学诊断方法检测病毒抗原虽然具有一定的灵敏度,但是操作繁琐,周期较长。PCR可以检测血液、粪便、分泌物中CS FV的核酸,实现早期诊断,在CSFV的检测中发挥重要的作用(傅烈振等,1998;张朝红等,2007;刘建柱等,2003。近年来发展起来的实时荧光定量PCR检测技术将PCR与荧光检测结

4、合起来,克服了传统PCR的假阳性和不能准确定量等弊端,可对样本中的核酸进行准确的定量检测,具有操作简单、结果直观、准确定量等优点,已经成为病原体检测的收稿日期:2010 08 20作者简介:李军(1971-,男,广东人,副研究员,博士,主要从事动物疫病防治研究。通信作者:杨威。基金项目:广西自然科学基金(0728103。一个重要方法(O M ahony等,2002;Whelan等, 2003。本试验根据SYBR Green 荧光定量分析原理,对CSFV核酸进行实时荧光定量PCR分析,建立了一种快速、准确、特异的CSFV定量检测方法,实现了快速、灵敏和准确地检测CSFV的基因组拷贝数,为CSFV

5、的早期快速诊断提供了有力的工具。1 材料与方法1.1 材料1.2 方法拷贝/ L 的CSFV 阳性重组质粒,评价本方法的准确性和稳定性。 本方法对15份临床疑似猪瘟样本进行检测,在检测的15份样本中,有6份样本经兔体交叉免疫试验证实为猪瘟病毒阳性。2 结果2.1 荧光定量PCR 条件的优化 分别对退火温度和引物浓度进行优化,获得了CSFV 的荧光定量PCR 最佳反应条件和体系。总反应体系为25 L,其中Real M aster M ix 11 L 、上下游引物(5pmo l/ L各0.5 L 、cDNA 模板2.5 L 以及ddH 2O 10.5 L 。反应条件:95 预变性5m in;随后进

6、行40个95 20s,57 20s,68 20s 的循环;最后68 延伸5min 。2.2 熔解曲线分析 熔解曲线只有1个特异峰(图1,排除了非特异性产物和引物二聚体形成对结果带来影响的可能,同时说明设计的引物具有很好的特异性,PCR 反应条件得到了很好的优化。PCR 产物电泳结果显示为单一条带,大小与预期扩增片段大小一致(图2,可以判断PCR 为特异性扩增。2.3 标准品的制备和标准曲线的建立 CSFV RN A 经反转录合成cDNA 后,进行PCR 扩增,PCR 产物经胶回收后,与pMD18 T 载体连接,转化大肠杆菌DH 5 ,用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒,测序结果表明扩增序列与参考序列

7、一致。抽提阳性重组质粒,测D 260nm 值。根据分子质量及阿佛加德罗常数(6.023 1023分子数/m ol换算为分子拷贝数,按2 1010拷贝/ L 浓度的阳性重组质粒进行10倍梯度稀释,采用优化的反应条件进行实时荧光定量PCR 扩增(图3,当模板浓度为2 102拷贝/ L 时,仍有荧光曲线,表明该方法检测灵敏度为2 102拷贝/ L。 图3 荧光定量PC R 的扩增曲线以拷贝数的对数为横坐标,以Ct 值为纵坐标,得到标准曲线Ct =- 3.145 lo g 拷贝数+ 4.975(图4。标准曲线的斜率为-3.145,截距为4.975。通过从仪器读取待测样品的Ct 值,代入表达式就可以换算

8、出其初始拷贝数。 图4 CSFV 实时荧光PCR 的标准曲线2.4 实时荧光定量PCR 的特异性 分别提取CS FV 、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型共4种病毒的核酸进行实时荧光定量PCR,仅有CSFV 的扩增有扩增曲线产生,其余3种病毒的扩增均无扩增曲线出现,说明本方法有很好的特异性。2.5 实时荧光定量PCR 的准确性和稳定性试验 用2.0 106、2.0 105和2.0 104拷贝/ L 的标准样品同时进行实时荧光定量PCR,分别重复6次检测。它们的Ct 值分别为19.77+0.25、22.64+0.22、25.16+0.27,变异系数分别为1.26%、0.97%

9、和1.07%,均小于5%,表明本方法具有较好的准确性和稳定性。2.6 实时荧光定量RT PCR 的初步应用 应用本研究建立的实时荧光定量RT PCR 方法从15份临床疑似猪瘟样本中检测到6份猪瘟病毒阳性样本,其结果与兔体交叉免疫试验一致。同时利用其它猪瘟病毒特异性诊断引物对这15份临床样本进行了RT PCR 检测,其结果也与实时荧光定量RT PCR 的结果完全一致,说明荧光定量RT PCR 的准确性达到100%(廖素环等,2005。3 讨论荧光定量PCR 的检测方法有二种,一种是以T aqMan 探针为代表的杂交探针检测,另一种是以SYBR Gr een 为代表的染料检测(Bhudevi 等,

10、2001;M art nez 等,2008。SYBR Green 染料可以与双链DNA 的小沟结合,在波长497nm 下发射荧光信号,而且荧光强度的增加与双链DNA 的数量成正比,而未与双链DNA 结合的SYBR Green 染料分子不会发射荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步,达到实时定量的目的。与普通PCR 相比,SYBR Green 荧光定量PCR 的核酸扩增和检测都在同一管内进行,无需电泳检测PCR 产物,解决了PCR 假阳性和核酸染料溴化乙锭对环境的污染问题。整个检测过程可在1h 内完成,仅为普通PCR 检测时间的一半,从病料到结果检测只需2.5h,能满足临床

11、上猪瘟诊断的快速要求。与杂交探针荧光定量PCR 相比,SYBR Green 染料可以适用于任何基因的PCR 扩增,无需设计特定的探针序列,价格成本低廉。由于SYBR Gr een 染料与双链DNA 结合没有特异性,容易产生非特异性扩增,因此需要优化PCR 反应条件和得到单一的熔解曲线来增强检测的灵敏度和精确度(Simpso n 等,2000。本试验通过优化PCR 反应条件,在PCR 退火温度为57 ,引物浓度为5pm ol/ L 时,获得的熔解曲线只有一个特异峰,表明了该反应为特异性扩增,没有引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物的出现。 荧光定量PCR 的灵敏度检测结果表明,本试验建立的

12、方法最小检出量为2 102病毒基因组拷贝数/ L 。在特异性试验中该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型等常见的猪源病毒不存在交叉反应,说明本方法特异性强。对标准品分别重复6次检测,结果表明该检测方法具有良好的准确性和稳定性。将该方法用于临床样本的检测,其结果与兔体交叉免疫试验的结果一致。因此,本试验建立的具有高灵敏度和高特异性的荧光定量RT PCR 检测方法能为猪瘟实验室快速诊断和疫情监测提供一种快速、准确、简便的检测工具。参考文献1 刘建柱,崔玉东,刑华伟,等.RT PCR与兔体交叉试验检测猪瘟病毒感染的相关性研究J.中国兽医科技,2003,11:1621.2 张朝红

13、,张彦明,张永国,等.猪瘟病毒4种检测方法的比较J.西北农林科技大学学报(自然科学版,2007,5:2428.3 李军,熊艳芸,梁湘,等.广西巴马小型猪IL 4和IL 10基因的克隆和序列分析J.动物医学进展,2005,10:7377.4 李菲,赵立峰,高云航,等.猪瘟分子生物学诊断新进展J.中国畜牧兽医,2010,37(6:168170.5 梁仕岩,汤德元,黄涛,等.猪瘟诊断技术的研究进展J.猪业科学,2009,4:8892.6 廖素环,罗廷荣,吴显实,等.广西流行的猪瘟病毒株E2基因序列测定及分析J.中国生物制品学杂志,2005,3:196199.7 Bh udevi B,Weinstoc

14、k D.Fluorogenic RT PCR assay(TaqM anfor detection and classification of bovine viral diarrh ea virusJ.Vet M icrobiol,2001,83:110.8 M art nez E,Riera P,Sitj M,et al.Sim ultaneous detection andgen otypin g of p or cine reproductive an d res piratory s yndrome vi rus(PRRSVby real time RT PCR and amplic

15、on meltin g curve analysis using S YBR GreenJ.Res Vet S ci,2008,85:184 193.9 M euw issen M P,H orst S H,H uirne R B,et al.A model to es timate the financial consequen ces of classical sw ine fever ou t breaks:prin ciples and outcomesJ.Prev Vet M ed,1999,42,249 270.10O M ah ony J,Hill C A.Real tim e

16、PCR assay for the detection an d quantitation of M yc obacte rium av ium su bsp.p ara tubercu lo sis us ing SYBR Gr een an d the light cyclerJ.J M icrobiol M eth ods,2002,51:283293.11Sim pson D A,Feeney S,Boyle C,et al.Retinal VEGF mRNA measu red by SYBR Green flu orescence:a vers atile app roach to

17、 quantitative PCRJ.M ol Vis,2000,6:178183.12Wh elan J A,Rus sell N B,Whelan M A.A method for th e abs o lute quantification of cDNA u sing real tim e PCRJ.J Immun ol M eth ods,2003,278:261269.Establishment and Application of Real time Fluorogenetic Quantitative RT PCR for Detection of Classical Swin

18、e Fever VirusLI Jun,PAN Yan,XU AN Xiong biao,H U Shuai,M A Chun xia,XIE Yu zhou,CH EN Ze x iang,XU Li g an,XIE Yong ping,YANG Wei(Guang x i V eterinar y Research Inst itute,N anning530001,ChinaAbstract:T o establish a real t ime fluor og enetic quantitat ive RT PCR assay fo r detect ion of classical

19、 sw ine fever vir us(CS F V,t he5 no n t ranslated region sequences o f CSF V in GenBank were aligned and a pair of specific pr imers was desig ned fro m the conserv ed sequence w ithin5 non tr anslated r egion.T he reactive co ndit ions w ere o ptimized t o impr ov e the sensit ivity and specificit

20、 y o f the assay.T he r esults o f reproducibility of this assay wer e reliable and the intr a assay v ariat ions w ere not sig nifi cant.T he specificity test pr oved that this assay had a hig h specificit y w hich could not detected PRRSV,PRV and PCV2.T he assay also pr oven to be specific,and the detectio n limit was up to2 102copies.T he accuracy of real time fluor og enetic quanti tat ive RT PCR w as ev aluated by t esting15clinical samples.T he r esults of real time fluo ro genetic quantitat ive RT PCR wer e co nsistent w ith result