新型亚甲基四氢叶酸还原酶单核苷酸多态性研究方法检测恶性血液病易感性

1、新型亚甲基四氢叶酸还原酶单核苷酸多态性研究方法检测恶性血液病易感性                     作者：陈宝安姜妮祭美菊侯鹏 陆祖宏高冲                     &

2、#160;          丁家华,孙耘玉王骏程坚赵刚【摘要】  本研究探讨一种新型亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）单核苷酸多态性(SNP)检测方法，并用其检测恶性血液病遗传易感性。根据cDNA芯片原理制作一种目的基因芯片，利用双色荧光探针杂交进行SNP位点检测，测序法对该芯片检测结果的准确性进行验证,并以此对来自中国江苏地区的157例健康对照和127例恶性血液病患者(30例多发性骨髓瘤，28例非霍奇金淋巴瘤，22例急性淋巴细胞白血病，40例急性髓系白血病，7例慢性髓系白血病)的MTHFR基

3、因C677T多态位点进行检测。结果表明，为野生型、杂合型和突变型的叠加荧光分别显示为绿色、黄色和红色。测序结果与芯片结果吻合。677C和677T在病例和对照组的基因频率分别为58.7%、66.9%、41.3%和33.1%，差异有显著性（2=4.077, P=0.043）。677TT基因型发生MM相对风险明显增加（OR=4.21；95%CI=1.50-11.83；P=0.006）。结论：本芯片检测方法准确、高通量且价格低廉，适用于大规模样本SNP调查；C677T多态改变影响恶性血液病的发病风险。677TT基因型是MM的易感因素。 【关键词】  单核苷酸多态性； 基因芯片； 双色荧光杂交

4、； 亚甲基四氢叶酸还原酶； 恶性血液病A New Method for 5,10-Methylenetetrahydrofolate Reductase Single  Nucleotide Polymorphisms Genotyping Used to Study Susceptibility of Hematological MalignancyAbstractThe aim of this study was to set up a new method for 5,10- Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) single

5、nucleotide polymorphisms (SNP) genotyping, and to investigate  the hereditary susceptibility of hematological malignancy. Prepared an aimed gene microarray based on cDNA microarray theory, dual- color fluorescenece hybri- dization was used to detect SNP loci, and DNA sequencing was performed to

6、 confirm the results. The MTHFR C677T SNP loci of 157 controls and 127 patients with hematological malignancies (30 multiple myeloma, 28 non- Hodgkins lymphoma, 22 acute lymphoblastic leukemia, 40 acute myeloid leukemia, 7 chronic myeloid leukemia) from Jiangsu province were detected. The results sh

7、owed that  after overlapping, homozygous wild type, heterozygote type and homozygous mutant type yielded green, yellow and red fluorescence, respectively. DNA sequencing validated these results. The allele frequency of 677C and 677T in patients and controls were 58.7% and 66.9%, 41.3% and 33.1%

8、 respectively,  showing statistically significant difference (2=4.077, P=0.043). 677TT genotype showed a significantly higher risk of MM (OR=4.21; 95%CI=1.50-11.83; P=0.006). It is concluded that  this microarray- based method is accurate, high- throughput and inexpensive,  suitable f

9、or SNP genotyping in a large numbeer of individuals. C677T polymorphisms influence the risk of hematological malignancies. 677TT genotype is susceptive to MM.Key words single nucleotide polymorphism; gene microarray;  dual- color fluorescenece hybridization;  5,10- methylenetetrahydrofolat

10、e reductase;  hematological malignancy染色体DNA序列的某个位点上存在的单个碱基变化如果在人群中的发生频率超过1%，即为单核苷酸多态性（SNP）。表达基因平均每1 000 bp即出现一个SNP位点，是人类基因组序列变异的主要形式。在不同的人群中，SNP的频率分布有差异，这些差异可以代表某一种族或人群间的遗传差异。研究SNP有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性，以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应性。因此，有必要建立一种准确、费用低、适合大样本的SNP检测方法。近年来研究表明，叶酸缺乏和（或）叶酸代谢异常可导

11、致多种肿瘤的发生。亚甲基四氢叶酸还原酶（5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是叶酸代谢的关键酶，其基因C677T位点多态改变引起酶活性下降，已被证实它与多种肿瘤的易感性有关。为此我们建立一种芯片检测方法，并对恶性血液病患者的C677T位点进行初步分析。材料和方法研究对象目的片段的PCR扩增和纯化采用已报道的引物序列1，C677T位点的PCR反应体系为30 l，其中含10×的缓冲液3  l，25 mmol/L的Mg2+溶液2  l，10 mmol/L的dNTP 0.6  l，10  mol

12、/L的双侧引物各1  l ，1.25 U的Taq DNA聚合酶（5 U/L），提取的基因组DNA 1 l。扩增条件：94预变性5分钟，94变性30秒，62退火30秒，72延伸30秒，共35个循环，72延伸7分钟。扩增在Gene Amp 2400 PCR System上进行。QIAquick PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物。分光光度计对PCR产物进行定量并将产物溶于3×SSC缓冲液中，浓度为300 ng/l。目的片段芯片的制备及杂交将PCR产物通过PixSys 5500点样仪（Cartesian Technology Inc产品）点于氨基玻片上。点样后玻片水化30分钟，1

13、00快干2秒，400 mJ紫外交联，80干烤2小时。野生型探针677CC：5- Cy3-CGGGAGCCGATTT- 3，突变型探针677TT：5- Cy3-CGGGAGTCGATTT- 3。将荧光标记探针1 mol/L（野生型和突变型探针各半）与杂交液（Telechem）按体积13混合。在潮湿的杂交盒中37杂交2小时。室温下分别用2×SSC- 0.1% SDS 和 0.1×SSC -0.1% SDS清洗5分钟，灭菌双蒸水清洗2分钟后吹干玻片。用ScanArray Lite 微阵列分析系统 （BioScience Company产品）进行芯片扫描。统计学处理病例组和对照组的

14、MTHFR基因型的频率差异以2检验确定，P<0.05为差异有显著意义。恶性血液病和MTHFR基因多态性的相关性用比值比（odds ratio，OR）以及95的可信度（95% confidence interval，95%  CI）表示，OR值经过年龄、性别校正。所有统计分析均用SPSS 11.5 软件计算。结果样品微阵列的分析双色荧光杂交进行SNP分型原理为经过杂交扫描后，野生型样本能获得一个较强的Cy3荧光（绿色荧光），突变型样本获得一个较强的Cy5荧光（红色荧光），杂合型样本既可获得Cy3荧光又可获得Cy5荧光，经过叠加后能显示一个较强的“黄色”荧光。我们分析了恶性血液病的6个样本的C677T位点。附图A、B和C中显示了6个样品的荧光信号和附图D中显示了这些样品的荧光信号的强度值。从图中可以看到4个样品（1-4）显示了较强的Cy3荧光信号，并且显示了和背景接近的