新型蛋白标记荧光探针的合成及生物学测试

1、新型蛋白标记荧光探针的合成及生物学测试武祥龙,田敏,贺怀贞,韩洁,李剑利,史真*西北大学化学系,陕西西安(710069摘要:在甲基磺酸作用下,以2,4-二氯间苯二酚和3,6-二氯-4-羧基邻苯二甲酸酐为原料缩合得荧光素母体。该荧光素母体依次和三甲基乙酸酐、二异丙基胺盐、盐酸、三氟乙酸N-琥珀酰亚胺酯反应得到二新戊酸酯保护的荧光素N-琥珀酰亚胺酯。用6-氨基己酸和荧光素N-琥珀酰亚胺酯反应,然后用氨水脱去新戊酸酯保护基得到一种新型蛋白标记荧光探针。目标产物及所有中间体通过IR,1HNMR,MS和元素分析表征。对目标产物进行细胞标记生物学测试,并用共聚焦激光扫描显微镜扫描细胞图像,图像显示该荧光探

2、针具有很好的荧光性、光稳定性和生物相容性。关键词:荧光素,荧光探针,细胞标记,共聚焦激光扫描显微镜,合成中图分类号: O6251. 引言荧光素是首次于1871年由V on Bayer在氯化锌催化下通过间苯二酚和邻苯二甲酸酐缩合而成1,其在水溶液中最大吸收波长和发射波长分别在492nm和517nm,pH大于8时量子产率高达0.922。由于荧光强度大,许多荧光素衍生物被合成并用作荧光检测试剂,如5(6-羧基荧光素、5(6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯是应用最广泛的荧光衍生试剂3。将荧光素以共价键连接到多肽、核酸、寡聚核苷酸、蛋白质尤其是抗体、激素及其他生物分子上形成分子荧光探针,用于生物学检测及基因表达

3、4。荧光探针技术在分子生物学、微生物学、生物化学、分析化学等领域有着广泛的应用57。同时它的发展与生物技术、环境科学、诊断医学等学科紧密相关,根据荧光探针的用途可将其分为极性探针、膜电位探针、离子荧光探针、细胞骨架蛋白荧光探针等等8。共聚焦激光扫描显微镜(CLSM是上世纪80年代发展的先进的分子细胞生物学分析仪器,它通过独特的成像原理与技术,使用紫外线或者可见光激发的荧光探针9,可以观察固定的细胞组织切片,甚至是活细胞的结构进行实时动态观察,在亚细胞水平上观察诸如Ca2+浓度10、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化11,成为分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中强有力的工具。用

4、荧光素探针标记的细胞、蛋白质等可以清楚的在共聚焦激光扫描显微镜下成像。因此,荧光素探针的合成和应用研究具有重要意义,本文以2,4-二氯间苯二酚和3, 6-二氯-4-羧基邻苯二甲酸酐为原料,在甲基磺酸作用下缩合得荧光素母体,接入氨基酸连接链得到一种新型含氯荧光素类蛋白标记荧光探针,其合成路线如Scheme 1 所示。2. 实验部分2.1 试剂和仪器X-4型数字显微熔点仪;德国产VarioELCHNOS元素分析仪;美国Varian公司INOV A-400型核磁共振仪,溶剂为CDCl3,TMS作内标。GC agilent6980MsHp5973气相色11本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金(No

5、.20050697003和国家自然科学基金(No.20472067的资助。谱质谱联用仪;MALDI-TOF MS(Kratos AXIMA-CFR plus Shimadzu Co.UK质谱仪; EQUINOXX55型红外光谱仪,KBr压片或涂片;共聚焦激光扫描显微镜(Bio-Red MRC-1024ES;F-4500型荧光分光光度计,薄层板自制;所用试剂均为分析纯。2.2 5(6-羧基-2,4,4,5,7,7-六氯荧光素的合成取41.1g(0.23mol 2,4-二氯间苯二酚和26.1g(0.01mol3,6-二氯-4-羧基邻苯二甲酸酐加入500mL三口瓶中,加入200mL甲基磺酸,氮气保护

6、下150反应48小时1,反应完毕后将反应混合物倾入冰水中,有大量砖红色沉淀析出。抽滤,0.1mol/L盐酸洗涤一次,得粗品5(6-羧基-2,4,4,5,7,7-六氯荧光素A,用V(甲醇:V(水 =1:1混合溶剂重结晶,得粉红色固体,产率75%。2.3 5(6-羧基-2,4,4,5,7,7-六氯荧光素二特戊酸酯的二异丙基胺盐的合成取9.0 g (15mmol 5(6-羧基-2,4,4,5,7,7-六氯荧光素,加入18mL三甲基乙酸酐,回流2h,冷至室温。加入20mLTHF和120mL水,剧烈搅拌2h后用乙醚萃取,有机层用pH=7的磷酸盐缓冲溶液洗涤(40mL×3,再依次用50mL1mo

7、l/L盐酸,50mL饱和氯化钠溶液洗涤,无水MgSO4干燥。蒸除溶剂,残余物用80mL无水乙醇溶解,加入10mL二异丙基胺后在-20下冷冻过夜2。得白色沉淀,抽滤得到粗品胺盐,用无水乙醇重结晶得B,白色粉末状固体,产率40%。2.4 5(6-羧基-2,4,4,5,7,7-六氯荧光素特戊酸酯的合成取7g(8.2mmol化合物B,溶于30mL二氯甲烷中,用1mol/L盐酸洗涤(30mL×3,有机层用无水MgSO4干燥。蒸除溶剂得到白色粉末状固体C,产率95%。2.5 5(6-羧基琥珀酰亚胺酯-2,4,4,5,7,7-六氯荧光素特戊酸酯的合成将4.8g(6.5mmol化合物C溶于150ml

8、二氯甲烷中,加入16mL吡啶和12mL三氟乙酸N-琥珀酰亚氨酯,剧烈搅拌3060min,TLC监测至反应完全。反应混合物依次用4%盐酸(100mL×3、饱和氯化钠溶液(100mL×2 洗涤,无水Na2SO4干燥,蒸除溶剂,干燥得白色固体D,产率85%,2.6 5(6-酰氨己酸-2,4,4,5,7,7-六氯荧光素特戊酸酯的合成将 5.5g(6.5mmol化合物D溶解在50mL二氯甲烷中,搅拌下滴加20mL6-氨基己酸(7.7mmol,0.9g的二氯甲烷溶液,滴加完毕后继续搅拌12h,TLC监测至反应完全。蒸除溶剂得粉红色固体,以乙酸乙酯和氯仿混合溶剂为洗脱剂V(乙酸乙酯:V(

9、氯仿=1:3,柱色谱分离得白色纯品E,产率83%。2.7 5(6-酰氨己酸-2,4,4,5,7,7-六氯荧光素的合成将5.2g(6mmol化合物E溶解在三氯甲烷中,滴加浓氨水,搅拌2h,分出水层,用浓盐酸调pH=2得粉红色沉淀,抽滤干燥得化合物F,产率75%。2.8 5(6-酰氨己酸琥珀酰亚胺酯-2,4,4,5,7,7-六氯荧光素的合成4%盐酸(10mL×3、饱和氯化钠溶液(10mL×2 洗涤,无水Na 2SO4干燥,蒸除溶剂,干燥的粗品,用乙酸乙酯重结晶得红色固体G ,产率80%。2.9 细胞标记及其图象采集按照荧光素类探针标记细胞的常规操作步骤12-14,将该荧光素探针

10、用于细胞标记实验。移取20mL5mg/mL 的储备液于1000mL 容量瓶中,用0.1mol/L 的磷酸盐缓冲液(PBS 定容,摇匀得100µg/mL 的溶液,再移取10mL 浓度为100µg/mL 的该溶液,加入1000mL 容量瓶中,用用0.1mol/L 的的磷酸盐缓冲液定容,得到适合标记细胞的1µg/mL 荧光素探针标记液。 2. i Pr 2NHO OO ClCl ClCl O CH 3H 3C H 3CO H 3C CH 3CH 3O O ClClOO NH 2CH 3H 3C H 3CCH 3HClPyridine/CH 2Cl 2O O O ClCl

11、ClClO CH 3H 3C H 3C O H 3C CH O O Cl Cl O NOOO 33OO O ClClClClO CH 3H 3C H 3C O H 3C CH3CH 3O O ClCl HOOC NH 3/H 2ON O ABCDEFGScheme 1 Synthesis routes of the chlorinated fluorescein probe dyes以甲醛作为细胞的固定剂,将3mL甲醛溶解在磷酸盐缓冲液中,转移至100mL容量瓶中,配置成含甲醛3%(体积分数的磷酸盐缓冲溶液。将待标记的人体骨肉瘤上皮细胞(U2OS加入96孔细胞培养板中,加入50mL3%甲醛溶液

12、培养3040min,将细胞固定,用磷酸盐缓冲溶液洗涤23次,即可将细胞固定。在96孔细胞培养板上加入50mL1µg/mL荧光素探针标记液进行标记反应,用磷酸盐缓冲液控制pH值,标记反应时pH值为7.5,室温下进行23小时,用磷酸盐缓冲液洗涤,除去过量的荧光素探针染料,密封96孔细胞培养板,即可进行扫描。以氩-氪激光为激光光源,激发波长为488nm,所用的共聚焦激光扫描显微镜的型号为Olympus IX71,物镜镜头为Planapo 40倍油浸镜头,数值孔径为1.0。在FITC通道上采集用甲醛固定的六氯荧光素蛋白标记荧光探针标记的人体骨肉瘤上皮细胞(U2OS荧光图象如图Fig 2所示,

13、在TRITC通道下采集用甲醛固定的六氯荧光素蛋白标记荧光探针标记的人体骨肉瘤上皮细胞(U2OS荧光图象如图Fig 3。3. 结果与讨论3.1中间体及目标产物的表征数据化合物A:C21H6Cl6O7,MALDI-TOF MS,m/z:581.90(Calcd:582.99,熔点大于310。1HNMR(CDCl, 400MHz: 11.15(s, 1H,-COOH, 8.54(s, 1H,ArOH, 8.22(s, 1H, 5- ArH ,36.86 (S, 2H, 1 and 8-ArH。元素分析:C21H6Cl6O7, 测定值(计算值%:C 43.21 (43.26 , H 1.05(1.04

14、。IR(cm-1:3480, 1768, 1709, 1478, 1433。化合物B:C37H37Cl6NO9, MALDI-TOF MS,m/z:852.52(Calcd:852.41,熔点大于300, 1HNMR(CDCl,400MHz:6.87(s,2H,1 and 8-ArH,7.81(s,1H,5-ArH,3.25(s, 2H, -NH2,1.443(s,18H,-tBuH,1.24(s,12H,i-propy H。元素分析:C37H37Cl6O9, 测定值(计算值%:C 52.08(52.13, H 4.39(4.38 ,N1.66(1.64。IR(cm-1: 2979, 2874

15、, 1775, 1642, 1425, 1214, 1075, 682。化合物C:1HNMR(CDCl3, 400MHz:6.87(s, 2H,1 and 8-ArH, 8.20(s, 1H, 5- ArH,1.44 (s,18H,-tBuH。元素分析:C31H22Cl6O9, 测定值(计算值%:C 49.52(49.56, H 2.94(2.95。MALDI-TOF MS, m/z:751.30(Calcd:751.22。IR(cm-1:2977, 1778, 1589, 1454, 1425, 1369, 1212, 1078。化合物D:1HNMR(CDCl3, 400MHz: 8.29(

16、s, 1H, 5- ArH, 6.88(s, 2H, 1 and 8-ArH,2.94(s, 2H, -CH2CH2-, 1.45(s, 18H,-tBuH。元素分析:C35H25Cl6NO11, 测定值(计算值%:C 49.61(49.56, H 2.96(2.97 , N1.67(1.65。MALDI-TOF MS,m/z:848.25, 751.86(Calcd:848.29。IR(cm-1:3365, 2947, 1780, 1739, 1647, 1436, 1373, 1210, 1065, 647。化合物E:1HNMR(CDCl3, 400MHz:6.89(s, 2H,1and

17、8-ArH,7.86(s,1H,5-ArH, 3.52(t,2H,-CH2,1.67 1.72(m,2H,-CH2,1.471.51(m,-CH2,2.39(t,2H,-CH2,1.44(s,18H,-tBuH。元素分析:C37H33Cl6NO10, 测定值(计算值%:C 51.39(51.41, H 3.84(3.85 ,N1.59(1.62。MALDI-TOF MS,m/z:861.11,(Calcd:861.02。IR(cm-1:3378, 2975,1778, 1657, 1551, 1454, 1424, 1372, 1211, 1079, 1026, 754。化合物F:1HNMR(

18、CDCl3, 400MHz:6.87(s,2H,1 and 8-ArH, 7.82(s,1H,5- ArH, 3.41(t,2H,-CH2, 1.851.86(m,2H,-CH2,1.631.70(m,-CH2,2.34(t,2H,-CH2。元素分析: C27H17Cl6NO8, 测定值(计算值%:C 46.61(46.58, H 2.44(2.46,N2.03(2.01。MALDI-TOF MS,m/z:696.44,(Calcd:696.14。IR(cm-1:3395,2958, 1782,1658, 1548, 1430, 1216, 1090, 746。化合物G:1HNMR(CDCl3

19、, 400MHz: 11.20(s, 1H,-COOH, 8.66(s, 1H,ArOH, 7.91(s, 1H,5- ArH,7.28(s,2H,1and 8-ArH, 3.40(t, 2H, -CH2, 1.631.71(m, 2H, -CH2, 1.521.58(m, 2H, -CH2, 1.441.48(m, 2H, -CH2, 2.69(t, 2H, -CH2。元素分析:C31H20Cl6N2O10, 测定值(计算值%:C 46.89(46.94, H 2.55(2.54 ,N3.49 (3.53。MALDI-TOF MS,m/z: 792.84,(Calcd:793.22。测试探针染料的激发