通腑法开通玄府对大鼠脑缺血再灌注损伤血脑屏障及脑组织水通道蛋

1、通腑法开通玄府对大鼠脑缺血再灌注损伤血脑屏障及脑组织水通道蛋 作者：胡建芳， 余志辉， 汪峰， 黄培新， 尤劲松 【摘要】 目的研究通腑醒神胶囊（简称TFXSJN）通腑法开通玄府对大鼠大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，简称MCAO）再灌注损伤模型血脑屏障（blood brain barrier， 简称BBB）通透性及脑组织水通道蛋白作者：胡建芳， 余志辉， 汪峰， 黄培新， 尤劲松【摘要】 目的研究通腑醒神胶囊（简称TFXSJN）通腑法开通玄府对大鼠大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，简称MCAO）再

2、灌注损伤模型血脑屏障（blood brain barrier， 简称BBB）通透性及脑组织水通道蛋白4（Aquaporin-4，简称AQP4）mRNA表达的影响。方法采用线栓法制作大鼠MCAO模型,2 h后拔线造成缺血再灌注损伤。大鼠处死前2 h经股静脉注射伊文思蓝（Evans Blue，简称EB）并测量各组大鼠1，3 d及7 d时脑EB含量，以及拔线后12 h，1，2，3 d及7 d时间点大鼠神经行为评分、脑组织AQP4mRNA的表达水平。结果TFXSJN治疗后能明显减轻大鼠在1，2，3 d及7 d时的神经功能评分，与模型组相比有明显差异（P0.05或P0.05）；TFXSJN组及模型组大鼠

3、脑组织损伤侧AQP4 mRNA的表达在12 h时已经明显升高，与健侧、假手术组及正常组相比均具有显著性差异（P0.01）；模型组在3 d时达高峰，TFXSJN组在2 d时达高峰，3 d时已有所下降，与模型组损伤侧相比有明显差异（P0.05），但仍高于健侧（P0.05）。假手术组在各时点内其损伤侧AQP4 mRNA表达水平与健侧及正常组相比均无明显差异（P0.05）。结论脑急性缺血再灌注损伤时存在BBB通透性的增高和AQP4 mRNA基因表达的上调。而TFXSJN通腑法开通玄府法能够调节缺血再灌注损伤后BBB通透性增高与AQP4 mRNA表达的失衡，减轻缺血再灌注损伤，从而起到神经保护作用。其调

4、节BBB通透性与AQP4mRNA基因的异常表达可能是通腑法开通玄府治疗缺血性中风的分子机制之一。因此推测玄府与BBB及细胞膜上通道蛋白（如AQP4等）之间可能存在共同的实质内涵。 【关键词】 腑法 开通玄府 缺血再灌注损伤 血脑屏障 脑组织水通道蛋白4 中医认为中风病存在玄府郁闭的病理状态，通腑法的目的在于开通玄府，调节玄府功能。而对于玄府本质的认识，现代医家认为玄府是机体内最微小的腔道，在结构及功能上体现了“孔”“缝隙”的内涵实质，与现代医学的细胞间隙十分相似，与微循环、离子通道有着许多共性内涵1,2。因此，本实验旨在研究TFXSJN通腑法开通玄府对大鼠急性局灶性脑缺血再灌注损伤模型的治疗作

5、用及其对BBB通透性和神经细胞膜上AQP4 mRNA基因表达的影响，试图从调节BBB通透性及细胞膜上通道蛋白表达的异常来诠释通腑法开通玄府治疗急性缺血性中风的可能作用机制，探讨通腑法开通玄府与BBB及神经细胞膜上通道蛋白之间的相关性，有助于从现代科学的微观指标解释通腑法的实质内涵，为中风病的现代化研究及中西结合找到切入点和开拓新思路。1 材料与仪器1.1 动物及药物SPF级雄性SD大鼠，体重250300 g，由广州中医药大学动物实验中心提供（合格证编号：0014930）。TFXSJN由广东省中医院制剂科提供（由番泻叶、虎杖、人工牛黄、天竺黄、栝蒌仁等药物组成）。1.2 材料及试剂TRIZOL

6、(美国sigma 公司产品)、DEPC(美国sigma 公司产品)、玻璃匀浆器、1.5 ml Eppendorf管、氯仿、异丙醇、无水乙醇、2伊文思蓝、甲酰胺、超低温离心机(BE CKMAN QS-15R Centrifuge)、螺旋振荡器、70冰箱、紫外分光光度计(Ultrospec4000)、1.5%琼脂糖凝胶、SSIII逆转录试剂盒(Invitrogen公司产品)、PCR扩增试剂盒(北京天为时代公司产品)、AQP-4上、下游引物及探针（序列参考相关文献，由上海生工合成）、PE7000全自动荧光定量PCR仪。2 方法2.1 分组与给药SPF级雄性SD大鼠138只，体重250300 g。随机

7、分为正常组（n6）、假手术组（n36）、模型组（n48）、TFXSJN组（n48）。TFXSJN按大鼠1.5g/kgd计算药量，按动物系数折算，相当于70 kg成人临床剂量的3倍。均于术前一天及术后麻醉清醒后，每日分两次灌胃给药（TFXSJN组）或者蒸馏水（正常组，假手术组，模型组），2 ml/次，上下午各1次。各组动物如有死亡应及时补充。2.2 MCAO缺血再灌注大鼠模型建立大鼠MCAO模型制作参照koizumi线栓法3，从右侧颈总动脉（Common carotid artery，简称CCA）进线，栓线采用尼龙渔线，长约4 cm，直径约0.26 mm，进线深度约1.8 cm,术后2 h拔出线

8、栓约1.5 cm形成缺血再灌注损伤。大鼠术中及清醒前均给予白炽灯（100 W）照射，保持肛温36左右，室温25。假手术组渔线插入CCA深度为0.5 cm，其余操作均同手术组。各组动物如有死亡应及时补充。2.3 脑组织伊文思蓝(Evans Blue，EB)含量的测定1，3 d及7 d时每组各取6只大鼠，于处死前2 h经股静脉注射2伊文思蓝2 ml/kg，2 h后开胸通过左心室灌注生理盐水(灌注压为100 mm Hg)，直到右心房流出无色液体为止，迅速断头取脑，分开大脑半球，去除蛛网膜、血凝块及脑室脉络丛，测量右侧大脑半球的重量并记录，置已知体积的甲酰胺中，测量脑体积，继续加甲酰胺至脑体积的5倍，置37水