高同型半胱氨酸血症对小鼠金属硫蛋白合成的影响

1、    高同型半胱氨酸血症对小鼠金属硫蛋白合成的影响*        摘要目的：观察高同型半胱氨酸(Hcy)血症时小鼠组织金属硫蛋白(MT)含量的变化。方法：小鼠腹腔注射Hcy复制高Hcy血症模型。观察肝、心和肾组织的MT和丙二醛(MDA)水平。结果：肝、心和肾组织在Hcy组MT水平较对照组分别高210%(P0.01)、133%(P0.05)和60%(P0.01)。而丙二醛水平则分别高6%、52%(P0.05)和69%(P0.05)。注射Hcy同时用超氧化物歧化酶(SOD)处

2、理的动物，肝、心和肾组织MT含量较Hcy组分别低22%(P0.05)、33%(P0.05)和13%(P0.05)。丙二醛含量则分别降低24%(P0.05)、21%(P0.05)和48%(P0.01)。组织MT水平与MDA含量呈显著正相关。结论：Hcy可能通过氧化应激诱导MT生成。主题词高半胱氨酸；金属硫蛋白；应激中分类号文献标识码A文章编号1000-4718(2000)08-0678-03 Homocysteine induces metallothionein formation in miceLI Zai-quan, ZHANG Ying, XUE Lin,XU Song, WANG Xi

3、ao-hong, TANG Chao-shu(Laboratory Center, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034, China)LI Shu-lian(Department of Pathophysiology, Kaifeng Medical College, Kaifeng 475001, China)AbstractAIM: To observe the changes of metallothionein (MT) in various tissues of mice during hype

4、rhomocysteinemia. METHODS: Intraperitoneal injection of homocysteine into mice induced hyperhomocysteinemia. The contents of tissue MT and malondialdehyde (MDA) in liver, heart and kidney were determined. RESULTS: Compared with control group, tissue MT levels in Hcy-group animals were increased by 2

5、10% (P0.01) for liver, by 133% (P0.05) for heart and by 60% (P0.01) for kidney. Tissue MDA contents were increased by 6%, 52%(P0.05) and 69% (P0.05), respectively. However, in treated animals with Hcy plus superoxide dismutase (SOD), the tissue MT contents in liver, heart and kidney were decreased b

6、y 22% (P0.05)，33% (P0.05) and 13% (P0.05)，respectively, compared with Hcy alone group. Tissue MDA contents were decreased by 24% (P0.05), 21% (P0.05) and 48% (P0.01). There was a positive correlation between tissue MT content and MDA level. CONCLUSION: Hcy could induce tissue MT formation through ox

7、idative stress.MeSHHomocysteine; Metallothionein; Stress同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是甲硫氨酸代谢过程中产生的一种含硫氨基酸，临床和流行病学资料表明，高Hcy血症是心血管疾病的一个独立危险因子1。已证实Hcy具有损伤血管内皮、刺激血管平滑肌增殖和促进胶原合成等广泛生物学效应1。Hcy细胞损伤作用的机制目前尚未完全阐明。已知与其通过自身氧化对组织细胞产生氧化应激有关2。金属硫蛋白(metallothionein,MT)是富含巯基的应激蛋白，是体内迄今所知的最强的羟自由基清除剂3，氧化应激、重金属离子、多种炎症因子等都能

8、诱导肝、肾等脏器的MT合成，在这些应激反应中，MT起着适应性细胞保护作用3，4。本工作观察高Hcy血症小鼠肝、心和肾脏组织MT含量的变化。以探讨Hcy通过氧化应激诱导组织MT生成的可能性。材料和方法一、小鼠高同型半胱氨酸血症模型复制昆明小鼠，体重(30±5) g，随机分为3组(每组n=6)。 (1)高Hcy组：Hcy，16 mol/kg溶于生理盐水，每日腹腔注射1次，连续2日。(2)对照组：以相同容积(8 mL/kg)的生理盐水代替Hcy腹腔注射。(3)高Hcy+SOD组：Hcy与超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)(2.25× 105U/kg

9、)同时腹腔注射，余操作同Hcy组。全部动物均于末次注射后的次日，腹腔注射肝素(500 U/只)，断头处死，腹腔静脉取血，分离血浆，并摘取肝、心和肾脏置-70冰箱保存。二、组织金属硫蛋白测定组织标本以5倍体积10 mmol/L Tris-HCl, pH7.4缓冲液匀浆，离心，取上清，100煮沸5 min，离心，去除沉淀。组织上清液蛋白定量后按109Cd-血红蛋白饱和法5测MT：取200 L组织上清液，加入200 L109Cd2液(含Cd22.0 g/mL和109Cd237 kBq/mL)。混匀37温育10 min。加入100 L2%牛血红蛋白，充分混匀，100煮沸2 min，冷却，离心，去沉淀，

10、反复牛血红蛋白沉淀操作3次。从上清液中取500 L于-计数仪上测定109Cd2放射强度，并换算出组织MT含量(pmol/)。三、组织丙二醛含量测定67，以考马斯亮兰法测定组织匀浆液蛋白含量。五、材料来源昆明小鼠，北京医科大学动物部提供。Hcy和牛血红蛋白为Sigma公司产品。SOD为中国科学院上海生物化学研究所产品。109Cd2结果一、血浆Hcy含量Hcy组动物血浆Hcy含量较对照组动物高828%(104±12 vs 13±4 mol/L， P0.01)，SOD组动物血浆Hcy的含量为109 mol/L，与Hcy组相近(P0.05)。二、Hcy对组织MT含量的影

11、响Hcy注射诱导小鼠肝、心和肾组织MT生成，其含量分别较对照组高210%(P0.01)，133%(P0.05)和60%(P0.01)，注射Hcy同时应用SOD的动物肝、心和肾组织MT水平较Hcy组分别低22%(P0.05)，33%(P0.05)和13%(P0.05)(表1)。LiveHeartKidneyControl46±159±315±4High Hcy143±16*21±10*24±4*SOD+high Hcy112±11*14±4*21±4*     * P

12、0.05， *P0.01， vs control group respectively; P0.05， vs high Hcy group LiveHeartKidneyControl4.7±0.93.1±0.91.6±0.6High Hcy5.0±0.84.7±0.8*2.7±0.6*SOD+high Hcy3.8±0.93.7±1.21.4±0.6     *P0.05， vs control group； P0.05，P0.01， vs high Hcy gr

13、oup 三、Hcy对组织MDA含量的影响高Hcy组动物肝、心和肾组织MDA含量较对照组分别高6%(P0.05)、52%(P0.05)和69%(P0.05)，SOD+高Hcy组肝、心和肾组织MDA较高Hcy组分别低24%(P0.05)、21%(P0.05)和48%(P0.01)(表2)。四、组织中MT含量与MDA含量的正相关性对照组和高Hcy组动物组织MT含量与组织MDA含量呈显著正相关。在肝脏r=0.58(P0.05)，心脏r=0.82(P0.01)，肾脏r=0.92(P0.01)。讨论Hcy是体内甲硫氨酸分解代谢的中间产物，体内甲硫氨酸通过S-腺苷甲硫氨酸等代谢生成Hcy,Hcy在胱硫醚-合

14、成酶作用下，以维生素B6做辅助因子，与丝氨酸结合形成胱硫醚，进一步形成半胱氨酸。Hcy也可在甲硫氨酸合成酶作用下，以维生素B12做辅助因子，以N5甲基四氢叶酸或甜菜碱做甲基供体重新合成甲硫氨酸8。高Hcy血症在动脉粥样硬化 ，心脑血管疾病，血栓形成等血管损伤有关疾病中作为独立危险因素起作用8、9。Hcy的细胞损伤机制目前尚未完全阐明，其中Hcy的氧化应激损伤是重要的发病环节。Hcy自身氧化过程中产生H2O22、Cu2+等金属离子时，可产生具有强烈细胞毒性的羟自由基2、8。MT是体内广泛分布的一种非酶类应激蛋白，有适合与Zn2等金属离子结合的空间结构，一个MT分子可结合6个二价金属离子3。MT除

15、具有解除重金属中毒外，还具有清除自由基抗氧化损伤等细胞保护作用。重金属离子、糖皮质激素、氧自由基、肿瘤坏死因子、白细胞介素-1等都可诱导MT高表达3。本工作在外源给予Hcy造成的小鼠高Hcy血症模型上观察到高Hcy血症诱导小鼠肝、心和肾组织MT合成，MT的这种诱导合成被应用氧自由基清除剂SOD而明显抑制。同时还发现高Hcy对小鼠产生氧化损伤，表现为组织脂质过氧化终产物丙二醛(MDA)含量增加，而SOD处理明显减轻Hcy刺激的MDA生成，亦抑制Hcy刺激的MT合成。实验动物组织MT含量与MDA含量间呈显著正相关。这些实验结果表明Hcy能诱导组织MT生成，其机制可能与Hcy氧化应激损伤作用有关。大

16、量实验表明，在心肌缺血缺氧、缺血-再灌注损伤等病理过程中，MT高表达都具有细胞保护作用，参与了机体的防御和代偿机制10。本实验观察到Hcy诱导机体MT生成，可能是机体的适应性保护反应，这种反应在伴高Hcy血症的血管损伤性疾病中的病理生理意义，有待进一步研究。基金项目国家自然科学基金资助(No. 39730220)李淑莲（开封医学专科学校病理生理教研室， 河南 开封 475001）李载权（北京医科大学第一医院中心实验室，北京 100034）张英（北京医科大学第一医院中心实验室，北京 100034）薛琳（北京医科大学第一医院中心实验室，北京 100034）许松（北京医科大学第一医院中心实验室，北京

17、 100034）王晓红（北京医科大学第一医院中心实验室，北京 100034）唐朝枢（北京医科大学第一医院中心实验室，北京 100034）参考文献1田学军，周爱儒，汤健.同型半胱氨酸对大鼠VSMC增殖的作用J.中国生物分子学与分子生物学报，1998，14(1)：108111.2Kim WK, Pas YS. Involvement of N-methyl-d-aspartate receptor and free radical in homocysteine mediated toxicity on rat cerebellar granule cells in cultureJ. Neuro

18、sci Lett, 1996, 216(2):117120.3李淑敏，胡大一，唐朝枢.金属硫蛋白的生物学效应J.国外医学、生理、病理科学与临床分册，1996，16(1)：3638.4Mato, Bremner I. Oxygen free radicals and metallothionein free radicalJ. Biol Med, 1993, 14:325331.5David LE, Brain FT. Evaluation of the Cd/hemoglobin affinity assay for the rapid determination of metallothionein in biological tissuesJ. Toxical Appl Pharmacol, 1982, 66:134140.6Asakawa T,