Brg1 在喉鳞状细胞癌中的表达及意义

1、Brg1 在喉鳞状细胞癌中的表达及意义    摘 要：目的：研究Brg 1 基因在喉鳞状细胞癌（LSCC）组织中的表达，探讨其与肿瘤发生、发展的关系。方法：应用免疫组化技术分析30 例LSCC 以及10 例癌旁正常粘膜中Brg1的表达情况。结果：Brg1 在癌旁正常粘膜内阳性表达（灰度值为124.6±4.51），在LSCC 中（灰度值为159.2±7.69）表达较低，两组之间差异显著（P0.01）。Brg1 在高、中、低分化LSCC 中表达灰度值分别为：132.8±1.92、165.2±2.59、179.6

2、7;1.52，中分化、低分化分别与高分化鳞状细胞癌比较差异具有显著性（p0.01）；Brg1 在-期、 期、期表达的灰度值分别为：145.3±2.36、165.2±4.31、179.4±3.03， 期、期分别与-期比较差异具有显著性（p0.05）。Brg1 在有脉管侵润和无脉管侵润组表达灰度值分别为176.8±3.48 和143.5±8.26，两组之间差异显著（p0.01）。Brg1 在有淋巴结转移组和无淋巴结转移组表达灰度值为155.6±4.02 和161.7±3.52，组间无显著性差异（P0.05）。结论：Brg1 在L

3、SCC 中表达低，并与其发展及病理因素有关，可能是LSCC 发生的一个重要因素。关键词：喉癌；Brg1；免疫组织化学Brg1(brahma-related gene 1)是新发现的一种抑癌基因，是1993 年Khavari 等【2】利用果蝇的Brm（Brahma）DNA 片段为探针，筛选Hela 细胞cDNA 文库而分离得到的一个人类基因，属于进化上高度保守的SWI/SNF 染色质重塑复合物的成员之一。它由 35 个外显子和34 个内含子组成，其转录本的大小约为 5kb。Brg1 蛋白由1613 个氨基酸组成，其相对分子质量为 205kD，是一种磷酸化核蛋白，主要以ATP 依赖的方式通过破坏组

4、氨酸-DNA的接触而调节基因的表达。通过放射杂交图谱分析，已将Brg1 定位于19p13【1】。它主要通过ATP 水解产生的动力来影响细胞分裂过程中染色质的重排,使得一些特异性的基因不能表达和抑制【1】。国外学者在研究其与肺癌、前列腺癌、皮肤癌等的关系中，发现它是一种重要的抑癌基因。肿瘤的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程，其中癌基因的活化和抑癌基因的失活起到关键性的作用。研究表明，肿瘤在本质上是一种基因病，各种环境的和遗传的致癌因素可能以协同或序贯的方式引起细胞非致死性的DNA 损害，从而激活原癌基因或(和)灭活肿瘤抑制基因，加上凋亡调节基因和(或)DNA 修复基因的改变，使细胞发生转化

5、，被转化细胞可先呈多克隆的增生，经过多阶段的演进过程，其中一个克隆相对无限制的扩增，通过附加突变，选择性地形成具有不同特点的亚克隆(异质化)，获得浸润和转移的能力，形成恶性肿瘤。喉鳞状细胞癌（LSCC）是头颈部常见的恶性肿瘤，其相关癌基因和抑癌基因的研究很多，但Brg1 与喉癌的关系的研究，国内外均未见报道。本文采用免疫组化的方法，研究Brg1 在喉癌组织中的表达，探讨Brg1 与喉癌发生的作用。1.资料与方法1.1 临床资料 LSCC 组：为我院2008 年10 月2009 年10 月连续住院病例，且临床资料完整、术前均未施行放疗、化疗及介入治疗的原发性喉鳞状细胞癌手术切除标本存档蜡块30

6、例。年龄3786 岁，平均年龄59.1 岁。其中男20 例，女10 例。30 例喉癌中高、中、低分化鳞状细胞癌各10 例。按UICC（2002）分期标准进行分期，期1 例、期10 例、本课题得到教育部博士学科点专项科研基金（ 20060183040）资助。期9 例、期10 例；有淋巴结转移者12 例，无淋巴结转移者18 例，有喉旁组织脉管侵润者8 例、无喉旁组织脉管侵润者22 例。对照组：随机选择其中10 例癌旁粘膜，且病理阴性为正常组织标本。1.2 试剂 SP9710 试剂盒及DAB 显色试剂盒购自福州迈新生物制品公司，Brg1 抗体购自北京博奥森生物制品公司。1.3 免疫组化方法及结果判定

7、取得临床标本组织立即泡于10%甲醛固定液中固定24小时，予以常规石蜡包埋、切片，制成4mm 切片;先行HE 染色，再切片贴附于涂有多聚赖氨酸的玻片上备用待行下一步的免疫组化染色，检测采用免疫组化S-P 法(链霉素抗生物素蛋白一过氧化物酶)，按试剂盒说明书进行。结果判定：Brg1 染色阳性细胞为细胞质棕黄色，胞核蓝色，阴性为胞核蓝色，细胞质无色；每张切片连续选取五个视野应用图像分析方法（Motic Image Advanced3.2）测量灰度值。1.4 统计学分析用 SPSS14.0 统计软件进行统计处理，统计组间差别采用t 检验。P0.05为统计学差异有显著性。2.结果2.1 Brg1 在喉癌

8、及癌旁正常粘膜组织中的表达 Brg1 蛋白特异性着色位于细胞浆内，呈棕黄色颗粒染色。在癌旁正常粘膜中，可见细胞质内大量棕黄色颗粒染色，Brg1 呈阳性表达（见图1），其灰度值为124.6±4.51；而在LSCC 细胞质内表达程度明显降低，细胞质呈淡黄色或不着色（见图2），其灰度值为159.2±7.69。两者间差异有显著性（P0.01）。HE （×200） Brg1图1 Brg1 在癌旁正常粘膜内阳性表达（sp, ×200）Figure 1 The expression of Brg1 in normal mucosa ajacent laryngeal

9、cancer is strong with s-p methodHE（×200） Brg1图2 Brg1 在喉癌组织中表达减弱（sp, ×200）Figure 2 The expression of Brg1 in laryngeal cancer is weaker with s-p method.2.2 Brg1 表达与LSCC 临床病理学特征的关系 本组LSCC 免疫组化染色发现，Brg1表达与肿瘤分级及分期有相关性。高分化组分别与中分化组和低分化组相比，高分化组Brg1的表达较强，而中分化组和低分化组表达较弱，组间差异有显著性（p0.01）。、期分别与期和期比较，发

10、现期和期Brg1 的表达较、期明显减弱，差异具有显著性（p0.05）。有脉管侵润组Brg1 表达较无脉管侵润组明显减弱，两者差异有显著性（p0.01）。有淋巴结转移组与无淋巴结转移组相比，Brg1 表达无显著性差异（p0.05），考虑可能由于检测样本量不够大有关。具体结果见表1。表1 在LSCC 组织中Brg1 的表达与临床病理特征的关系Table 1 The relationgship between the expression of Brg1 protein in LSCC tissue and clinical pathologicalcharacters*compared with

11、well defferentiation # compared with-stage3.讨论染色质重塑是在基因调控中的关键步骤之一，最近已吸引人类癌症研究的强烈兴趣。Brg1 和Brm 是人的ATP 依赖的染色质重构复合物SWI/SNF 的核心催化亚基，SWI/SNF 在细胞周期调控、肿瘤发生和发育分化等重要生命活动中扮演重要角色【3】。David 等在研究Brg1 和Brm 在人正常组织中表达中发现Brg1 在分裂活跃的细胞中表达较高，而Brm 在脑、肝脏、肌浆细胞和上皮细胞表达较高【13】。Brm 在间质细胞中表达，但有趣的发现是在肉瘤细胞系中Brm 表达丢失；Brg1 在胰腺、肺和前列腺

12、癌细胞系中丢失，而在其正常组织中Brg1 表达，因此David 推测通过检测正常组织中Brg1 和Brm 的表达，在某种情况下可能预测蛋白将在肿瘤发展中丢失【13】。在本研究中发现癌旁正常粘膜中Brg1 阳性表达，而Brg1可通过上调p21 的表达及通过与网织细胞瘤阻遏蛋白（pRB）的相互作用来影响E2F 目标蛋白质的表达，从而在细胞周期调控中发挥重要作用。因此我们推测Brg1 在维持喉粘膜正常形态和功能中有一定的作用。有研究表明Brg1 可抑制原癌基因c-fos 的表达【4】。CD44 是一种与不同种类肿瘤的扩散转移都紧密相关的跨膜糖蛋白，Brg1 可调控CD44 的表达；Brg1 缺失的肿

13、瘤细胞系C33A不表达CD44，而Brg1 转化后，CD44 恢复表达，引入显性失活的Brg1 后，CD44 又停止表达，证明Brg1 是CD44 的关键调控因子【5】。在以往对LSCC 的研究中发现在LSCC 组织中c-fos 及CD44 表达明显高于正常组织，与LSCC 的发生有关。而本研究表明在LSCC 中Brg1 表达较癌旁正常粘膜中明显减弱，考虑由于Brg1 功能减弱，其对c-fos 及CD44 的作Clinical pathological n Brg1（gray value） pcharacterHistological defferentiationWell 10 132.8&

14、#177;1.92Moderate 10 165.2±2.59 0.01*Poor 10 179.6±1.52 0.01*Lymph node metastasisPositive 12 155.6±4.02Negative 18 161.7±3.52 0.05Clinical stages-stage 11 145.3±2.36 stage 9 165.2±4.31 0.05# stage 10 179.4±3.03 0.05#Vascular invasionYes 8 176.8±3.48No 22 143.

15、5±8.26 0.01用减弱，从而与LSCC 发生有一定相关性。关于 Brg1 与肿瘤关系，国内外许多学者都做了大量的工作。一些学者研究发现：在肺癌组织及多种肿瘤细胞系中，Brg1 的mRNA 与蛋白质表达下调或缺失【3，6-8】。但其表达下调的原因尚不清楚。此外，在非小细胞肺癌的研究中发现，Brg1 和Brm 表达下调与患者较差的预后相关【8】。而Sentani 等报道，胃癌组织中Brg1 的表达比正常组织明显增高【9】。何莲芝等研究发现Brg1 蛋白在宫颈鳞癌中高表达【10】。Brg1 作为抑癌基因，而在肿瘤细胞中高表达，分析其原因,可能与其启动子异常甲基化、基因突变及其转录激活

16、功能异常等因素有关。这时,异常表达的基因产物可能已失去抑癌基因原有的生物学效应作用,即功能丢失或产生转录激活作用。而关于Brg1 与喉癌的研究，国内外并无报道。本研究中，我们发现在喉鳞状细胞癌中Brg1 的表达较癌旁正常粘膜明显减弱。这结果与Brg1 作为抑癌基因调控基因表达是一致的。同时我们发现，Brg1 的表达和肿瘤分级、临床分期及脉管侵润等因素密切相关。提示Brg1 在术前预测喉癌分期、预后等方面可能有益。本研究中发现Brg1        表达与淋巴结转移无关，考虑本研究样本量不够大，Brg1 与淋巴结转移

17、因素的关系有待进一步研究明确。Brg1 作为一种抑癌基因，其功能减弱或缺失可导致细胞功能异常。Brg1 缺失突变杂合小鼠更易于发生肿瘤，说明Brg1 功能的减弱可导致细胞增殖的失控【11】。用Brg1 基因转化Brg1 功能缺失的ALAB、SW13 和TSU-Pr1 细胞系，出现了细胞生长停止和扁平细胞表型。说明Brg1 可以改变这些肿瘤细胞的表型，Brg1 功能的缺失是引起肿瘤的一个重要因素【12】。本研究发现在LSCC 中Brg1 的表达较癌旁正常粘膜明显减弱，病理分级从高分化到低分化，Brg1 的表达有逐渐减弱的趋势，同时晚期肿瘤Brg1 表达较早期肿瘤明显减弱，有脉管侵润者较无脉管侵润

18、者Brg1 表达明显减弱。表明Brg1 的功能减弱可能是LSCC 发生的一个重要因素，且与肿瘤的分级、分期及预后具有一定的相关性。Brg1 作为一个抑癌基因在LSCC 中表达降低，使得其抑制正常粘膜恶性转化的能力降低，细胞发生癌变，增殖能力增强，在导致肿瘤发生中起到作用。总之，Brg1 是一种抑癌基因，在喉正常粘膜内阳性表达，在喉癌组织中低表达，与喉癌的病理分级和临床分期密切相关。其功能减弱可能是LSCC 发生的一个重要因素。参考文献1 WongAK, Shanahan F, Chen Y, et a.l Brg1, a component of the SWI/SNF complex, is

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