基质金属蛋白酶-1、反义金属蛋白酶组织抑制因子-1表达质粒对大鼠肝纤维化的影响

1、基质金属蛋白酶-1、反义金属蛋白酶组织抑制因子-1表达质粒对大鼠肝纤维化的影响 【摘要】目的观察基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、反义金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)表达质粒对 大鼠肝纤维化的影响。方法运用重组DNA技术，构建大鼠MMP-1、反义TIMP-1真核细胞表达质 粒，经脂质体包埋后，利用腹腔注射将其导入免疫性大鼠肝纤维化模型体内，观察其对大鼠 肝纤维化的影响。结果MMP-1、反义TIMP-1表达质粒均可促进肝脏中、型胶原的降解 (P0.05P0.01)，且作用较秋水仙碱为强(P0.05)；在病理形态学的观 察方 面，MMP-1、反义TIMP-1表达质粒对肝纤维化有一定的逆转

2、作用(P0.05)，但MMP-1 表达质粒与秋水仙碱相比差异无显著性(P0.05)。结论MMP-1、反义TIMP-1表达质粒对肝纤维化均有不同程度的逆转作用 ，以两种质粒的联合应用效果最为明显，单独使用反义TIMP-1表达质粒次之，单独使用MMP -1表达质粒作用有限，从肝纤维化形成初期使用优于后期的治疗。【关键词】肝硬化；基质金属蛋白酶-1；反义金属蛋白酶组 织抑制因子-1Effects of matrix metalloproteinase-1 and antisense tissue inhibitor of metalloproteinase-1 recombinant plasmid

3、 on rat liver fibrosisYANG ChangqingHU GuolingTAN Deminget al.（Institute of infectious diseases, Xiangya hospital, Hunan Medical University, Changsha 410008, China）【Abstract】Objective To study the effects of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) and antisense tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TI

4、MP-1) recombinant plasmid on rat liver fibrosis. MethodsWe constructed the rats MMP-1 and antisense-TIMP-1 recombinant plasmids by reverse transcription-nested-polymerase chain reaction (RT-Nested-PCR) and the technique of DNA recombination. Af ter encapsulated by lipofectin, the MMP-1 and/or antise

5、nse-TIMP-1 recombinant plasmids was transferred to the rats with liver fibrosis in vivo intraperit oneall y, then the effects of the plasmids on the hepatic fibrosis were observed by RT - PCR for MMP-1 and TIMP-1, immunohistochemical assay for type and type co llagen, and Masson staining for the obs

6、ervation of pathology. ResultsThe recombinant plasmids of MMP-1 and antisense-TIMP-1 could enhance the degradation of type and type collagen in the rats fibr otic liver compared with fibrotic modal group (P0.01) or compared with colc hicine treated group (P0.05). Moreover the recombinant plasmids of

7、 MMP- 1 an d antisense-TIMP-1 have some reverse effects on the hepatic fibrosis compared with fibrotic modal group (P0.01P0.05 ). ConclusionThe recombinant plasmids of MMP-1 and antisense-TIMP- 1 have some reverse effects on hepatic fibrosis to a greater or less degree. U sing the two plasmids toget

8、her has the stronger effect than using the plasmid o f antisense-TIMP-1 alone and using the plasmid of MMP-1 only lead to a limite d changes.【Key words】Liver cirrhosis; Matrix metalloproteinase-1; Antisensetissue inhibitor of met alloproteinase-1基质金属蛋白酶(MMPs)在降解纤维化肝脏过多 细胞外基质(ECM)的过程中起主要作用，其中间质胶原酶(MM

9、P-1)在降解纤维化肝脏ECM的主 要成分、型胶原的过程中起重要作用1 。而对MMP-1活性起主要抑制作用的是金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)，在肝纤维化 过程中TIMP-1通过对MMPs(主要是MMP-1)活性的抑制，抑制了、型胶原等ECM的降解， 从而导致ECM在肝脏内的过度沉积，促进了肝纤维化的形成和发展2，3。我们 运用DNA重组技术构建可表达大鼠MMP-1基因和反义TIMP-1序列的真核细胞表达质粒，并将 其导入免疫性大鼠肝纤维化模型体内，观察MMP-1和反义TIMP-1重组表达质粒对实验动物 肝纤维化的影响。材料与方法一、构建重组质粒运用DNA重组技术我们构建了MMP-1

10、和反义TIMP-1的真核细胞表达质粒，并进行了酶切(1 )和测序鉴定4。 1. 泳道为pcDNA3/MMP-1的酶切鉴定，目的片段(MMP-1)的长度为1 458bp;2. 泳道为pcDNA3/反义TIMP-1的酶切鉴定，目的片段(TIMP-1)的长度为671bp1重组质粒的酶切鉴定二、动物实验(一) 模型制备Wistar大鼠，雌性，79只，体重120150 g，参照王宝恩等人用人血白蛋 白免疫攻击的方法制备大鼠免疫性肝纤维化模型5，抗大鼠IgG单抗为法国库尔 特(Coulter)公司产品。(二) 动物分组实验动物经过2次静脉免疫攻击后，按随机分组法对存活动物进行分组。C( -)组，即模型组，

11、按计划静脉注射白蛋白免疫攻击制作肝纤维化模型，不给予其他任何干预 因素。C(+)组，即秋水仙碱治疗组，自静脉攻击两周后给予秋水仙碱(0.28 mg/kg)灌胃治疗 ，6次/周。M1组(MMP-1预防组)：自静脉攻击2周后给予MMP-1重组质粒50 g,每2周1次至 第8周。M2组(MMP-1治疗组)：自静脉攻击4周后给予MMP-1重组质粒50 g，每2周1次至 第8周。T1组(反义TIMP-1预防组)：自静脉攻击2周后给予反义TIMP-1重组质粒50 g, 每2周1次至第8周。T2组(反义TIMP-1治疗组)：自静脉攻击4周后给予反义TIMP-1重组质 粒50 g，每2周1次至第8周。MT1组

12、(联合质粒预防组)：自静脉攻击2周后给予MMP-1、反 义TIMP-1重组质粒各50 g,每2周1次至第8周。MT2组(联合质粒治疗组)：自静脉攻击4周 后给予MMP-1、反义TIMP-1重组质粒各50 g,每2周1次至第8周。 N组：即正常对照组，每次静脉攻击时只注射等量生理盐水。除正常对照组外，其余各组实 验动物白蛋白静脉攻击按计划进行。(三) 重组DNA导入活体动物体内运用凝胶电泳法确定Lipofectin与重组质粒pcDNA3/MMP- 1和pcDNA3/反义TIMP-1的最佳配比均为1 g质粒DNA5 l Lipofectin。取50 g重组 质粒DNA与相应的脂质体包裹后，腹腔注射

13、。三、结果观察实验动物在静脉攻击第8周结束后，麻醉、取肝组织后处死。部分肝组织作抽提RNA用，部分 肝组织置于Carnoy组织固定液中，待作病理学检测和免疫组化用。(一) 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测MMP-1、TIMP-1的表达用RT-PCR法检测肝 组织中MMP-1和TIMP-1的表达，用Southern blot对RT-PCR产物进行鉴定6， 用像分析仪检测灰度值(IDV)对反应产物量化处理4(2)。 -actin为内对照2RT-PCR检测每一样本中MMP-1、TIMP-1的表达(二) 病理形态学观察对组织切片用Masson胶原染色法观察。肝纤维化病理学分级参照吉 中和等人的

14、标准7。(三) 、型胶原的免疫组化、型胶原免疫组化试剂盒为武汉博士德生物制品公司 产品，方法参照药盒说明。实验结果用像分析仪检测积分光密度值(ILD)(Eagle Eye 型 ，USA)计点量化处理。(四) 统计学处理MMP-1、TIMP-1的表达及、型胶原免疫组化的量化结果使用SPSS 7.0软件作方差分析(多样本均数内的两两比较)和相关分析，病理形态学的观察结果使 用EPI 5.0软件作趋势分析卡方检验。结果一、MMP-1的表达由表1可见：使用MMP-1重组质粒的动物肝脏中，MMP-1的表达量均较其他组显著增高，但 使用MMP-1基因治疗组之间(即M1、M2、MT1、MT2)及其他各组之间

15、(包括N、C(-)、C(+)、T1 、T2)差异均未见有显著性；正常对照组(N)与非MMP-1治疗的各组(C(-)、C(+)、T1及T2)之 间，肝脏MMP-1的表达差异无显著性。二、TIMP-1的表达由表1可见：各实验组TIMP-1的表达值均较正常对照组显著增高；使用反义TIMP-1重组质 粒的实验组，包括T1、T2、MT1、MT2，其TIMP-1值均较其他组低，其差别有显著性；使用 反义TIMP-1重组质粒的各组之间(T1、T2、MT1、MT2)，其TIMP-1的表达差异无显著性；秋 水仙碱治疗组与模型组相比其TIMP-1的表达有所降低，且P0.05。表1MMP-1、反义TIMP-1表达质

16、粒对实验动物肝组织中MMP-1、TIMP-1和、型胶原的影响组别MMP-1(IDV)TIMP-1(IDV)胶原(ILD) 胶原(ILD)N0.945 30.04572.06380.137562.3517.6299.9019.38C(-)1.31730.12235.62450.5518402.8577.93699.20112.07C(+)1.29380.20014.00570.4206*310.7066.49 *516.2571.16*M12.07350.3204*+5.08320.8879228.2345.31*+384.1044.72*+M21.84950.4035*+5.79541.314

17、1247.1841.18*+415.9059.69*+T11.170 10.227 43.284 60.735 9*+165.2045.34* +339.0046.08*+T21.059 80.335 03.731 11.051 3*+181.9541.26* +353.4052.36*+MT11.957 40.448 9*+3.366 21.255 3*+152.20 60.55*+277.8385.68*+MT22.019 50.533 5*+3.992 21.456 7* +165.5550.64*+301.5076.59*+ 各实验组与正常对照组(N)相比，：P0.001, ：P0.0

18、1, ：P0.05;各治疗组与模型组相比，*：P0.01, *：P0.05；基因治疗组与秋水仙碱组相比，+：P0.05三、病理形态学观察由表2可见：各实验组与正常对照组之间的病理学分级差异均有显著性；除秋水仙碱治疗组 之外，其余各实验组与肝纤维化模型组之间的病理学分级差异均有显著性，秋水仙碱治疗组 与肝纤维化模型组之间差异无显著性；MMP-1使用组(M1、M2)与秋水仙碱治疗组之间其病理 学 分级差异无显著性；联合预防组(MT1)与MMP-1使用组(M1、M2)之间的病理学分级差异均有 显著性，反义TIMP-1治疗组(T1)与MMP-1治疗组(M2)之间差异也有显著性；所有使用反义T IMP-

19、1的治疗组(T1、T2、TM1及TM2)之间差异均无显著性。四、型胶原的免疫组化由表1可见：各实验组肝组织中、型胶原含量均较正常对照组显著增多(P0.01P0.001)，而较肝纤维化模型组明显减少；基因治疗各组、型胶原含量均低于秋水仙碱治疗组；反义TIMP-1使用组(T1、T2)及联合质粒组(MT1、MT2)与MMP-1使用组(M1、M2)之 间相比，、型胶原量均低，且差异有显著性；从型胶原的含量变化看，MT1、MT2与T1 、T2之间尚存在显著差异；M1、M2之间，T1、T2之间、MT1、MT2之间、型胶原含量均差 异未见显著性。 表2实验动物肝纤维化的病理级别分布组别肝纤维化分级合计0N6

20、0000006C(-)00000336C(+)00012227M1*00232108M2*00123208T1*+02231008T2*+01231108MT1*+02321008MT2*+02221108 各实验组动物与正常对照组的差异性比较，：P0.05, ：P0.01； 各治疗组动物与模型组的差异性比较，*：P0.05, *：P 0.01； 基因治疗组与秋水仙碱组相比，+：P0.05；+：P0.01 讨论目前发现在病损肝脏中TIMP-1明显增高，出现的时间较早，幅度较大，因此有越来越多的 研究人员把它看作是肝纤维化发生过程中的一个非常重要的促发因素，通过对MMP-1等金属 蛋白酶活性的抑

21、制促进ECM的沉积3，8，9。我们在实验中发现在肝纤维 化 模型动物肝脏与正常动物之间，MMP-1的表达无明显差异，而TIMP-1的表达模型动物却较 正常对照组增高272%(5.624 5/2.063 8)以上。通过给予MMP-1和反义TIMP-1重组表达 质粒后 ，发现其MMP-1的表达明显增加，而TIMP-1的表达显著降低。这一方面说明运用脂质体包 裹表达质粒通过腹腔注射进行肝脏转移是可行的，另一方面也说明了重组表达质粒在活体内 能够确切表达。另外我们发现，秋水仙碱治疗组中TIMP-1的表达较模型组有所减少，可能 为秋水仙碱抗肝纤维化作用的机制之一。根据我们对实验动物的肝组织切片进行观察发

22、现，所有实验动物与正常对照组的肝组织病理 学分级相比均有显著差异，这说明使用MMP-1和反义TIMP-1基因治疗或用秋水仙碱治疗， 一定时间内均不能使病变肝脏完全恢复至正常。基因治疗各组与纤维化模型组之间存在差异 ，说明MMP-1、反义TIMP-1表达质粒对肝纤维化有一定的逆转作用。各组之间比较发现联 合质粒的使用或单用反义TIMP-1效果优于单用MMP-1；MMP-1使用组与秋水仙碱治疗组之 间差异无显著性，而秋水仙碱治疗组又与纤维化模型组之间差异无显著性，所以尽管MMP-1 使用 组与模型组之间存在差别，我们也认为单纯使用MMP-1作基因治疗其疗效是有限的。通过以上分析我们可以得出，从对肝

23、纤维化的逆转效果角度看，联合质粒的使用优于单用反 义TIMP-1，而反义TIMP-1的使用又优于MMP-1，单独使用MMP-1作用有限。出现这样的结 果，我们认为是符合肝纤维化形成过程中的病理生理机制的。在肝纤维化形成的过程中，MM P-1的表达并无显著减少，根据我们前述的实验结果甚至还轻度增加。增加的MMP-1为什么 没有导致胶原的降解，我们认为是由于其活性被更大幅度增加的TIMP-1所抑制，所以单纯 给予MMP-1治疗作用有限；而通过给予反义TIMP-1封闭纤维化肝脏TIMP-1的表达，则可使 体内固有的MMP-1的活性得到释放，从而导致胶原的降解；如果同时给予反义TIMP-1、MMP -

24、1，则不仅可以释放体内固有的MMP-1的活性，而且使外源导入的MMP-1的表达产物也具 有降解胶原的作用。承湖南医科大学湘雅医院病理科程瑞雪教授、冯德云讲师在病理学观察中给予大力帮助 ，谨致谢意。作者单位：杨长青（410008长沙，湖南医科大学湘雅医院传染病研究所）胡国龄（410008长沙，湖南医科大学湘雅医院传染病研究所）谭德明（410008长沙，湖南医科大学湘雅医院传染病研究所）张铮（410008长沙，湖南医科大学湘雅医院传染病研究所）杨长青（现在上海医科大学 中山医院内科）参考文献1，Matrisian LM. The matrix-degrading metalloproteinases. Bioessays, 1 992,14:455-463.2，Iredale JP. Tissue inhibitors of metalloproteinases in liver f