微泡造影剂及超声促进绿色荧光蛋白质粒在人肝癌细胞HepG2内表达的实验研究

1、微泡造影剂及超声促进绿色荧光蛋白质粒在人肝癌细胞HepG2内表达的实验研究        【摘要】     目的研究微泡造影剂与超声辐照是否能提高绿色荧光蛋白质粒在人肝癌细胞HepG2中的转染率。方法将培养的HepG2细胞分为四组：第一组为对照组；第二组以脂质体转染；第三组加入微泡造影剂SonoVue并予以超声辐照；第四组加入脂质体和微泡造影剂SonoVue并予以超声辐照，将含有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N1转染人肝癌细胞HepG2，24小时后以

2、荧光显微镜观察人肝癌细胞HepG2中的绿色荧光蛋白表达情况，并用流式细胞仪测算转染率。结果脂质体转染组与微泡造影剂+超声辐照组有显著性差异（P<0.05）, 脂质体+微泡造影剂+超声辐照组与微泡造影剂+超声辐照组有显著性差异（P<0.01）结论微泡造影剂和超声辐照协同脂质体能提高目标基因在肝癌细胞内的转染率。     【关键词】  微泡造影剂； 超声辐照； 基因转染； 肝癌细胞     Ultrasound and microbubble contrast agent improve

3、d pEGFP-N1 transfection into cell HepG2: in vitro experiment study   ZHENG Ying, WANG Wen-ping, ZHAO Ping, ZHAO Yi-wen  Department of Ultrasound, Zhongshan Hopsital of Fudan University, Shanghai 200032, China    【】  Objective  to investigate whether ultrasound

4、 and microbubble contrast agent SonoVue could improve gene transfection into HepG2 cells in vitro.  Methods The cultured HepG2 cells were divided into 4 groups: the first group was control group, the second group was given liposome with plasmid pEGFP-N1, the third group was exposed with ultraso

5、und and microbubble contrast agent SonoVue, and the fourth group was both given liposome and SonoVue then exposed with ultrsound. After 24 hours, the expression of pEGFP-N1 was studied by fluorescence microscope and the transfection efficiency was calculated by flow cytometry. Results There were sig

6、nificant difference between the second and the third group(P<0.05), also between the third and the fourth group(P<0.01). The highest transfection effect appeared in the fourth group. Conclution Ultrasound and microbubble contrast agent can improve transfection efficiency with liposome into hep

7、atic carcinoma cells.    【 】  Microbubble contrast agent; Ultrasound; Gene transfer;  Hepatoma carcinoma cell    原发性肝癌目前仍是我国的常见肿瘤之一，随着分子生物学的快速发展，治疗方法从传统的手术治疗、化疗治疗转向了基因治疗。基因治疗作为一种在分子水平干扰和纠正疾病的治疗手段1，为癌症的治疗带来了希望，但同时还存在许多问题尚待解决。其中较突出的问题之一就是如何将外源基因高效地转入靶细胞内。本研究通过比较

8、不同的转染方式将荧光蛋白转入人肝癌细胞HepG2，旨在探讨一种更高效和安全的基因转染方式，为肝癌的基因治疗提供新的思路。    资料与方法    一、材料与仪器    1. 材料：人肝癌细胞HepG2株购自上海细胞研究所。 Lipofectamine2000阳离子脂质体（美国Invitrogen公司）。 声诺维SonoVue（注射用六氟化硫微泡）冻干剂（意大利博莱科公司）。增强型绿色荧光蛋白质粒pEGFP-N1，第二军医大学微生物研究室惠赠。    2. 仪器：百胜公司Myl

9、ab 25超声诊断仪，探头频率2.53.5MHz，MI 0.11.1， 荧光显微镜为Olympus产品，6孔培养板购自Corning。    3. 细胞培养 人肝癌细胞株HepG2复苏后，常规培养于含10小牛血清的DMEM培养液中。    4. 质粒提取  质粒 pEGFP-N1转化大肠杆菌DH5， 单菌落增菌培养至200 ml，用Qiagen的Max Columu Kit抽提和纯化质粒，溶解于灭菌重蒸水，浓度1mg/ml，OD 260/2801.8。    5. SonoVue微泡造影剂的制备

10、    将5ml生理盐水注入SonoVue药瓶中，用力震荡使药物混合均匀。    二、实验方法    在6孔板中每孔加入2ml细胞悬液及5l荧光蛋白质粒（1g/ml），分4组，每组5孔：    A组：对照组 细胞悬液+质粒    B组：细胞悬液+质粒+脂质体10l    C组：细胞悬液+质粒+40微泡造影剂+超声辐照5min    D组：细胞悬液+质粒+脂质体10l+40微泡造影剂+超声

11、辐照5min    转染后将培养板放入5CO2孵育箱中培养5小时，更换新鲜培养基，继续培养24小时。    三、分析方法    荧光显微镜观察转染后人肝癌细胞HepG2中的绿色荧光蛋白表达情况，用流式细胞术检测表达GFP的细胞百分率。    四、统计学分析    计量数据采用平均数±标准差表示，组间均数比较分析用t检验，采用SPSS 12.0统计软件进行方差分析。P<0.05差异有统计学意义。   

12、结果    1. 流式细胞仪检测各组细胞内pEGFP表达率（见表1），显示B组与C组比较有显著性差异（P<0.05）；D组与B组比较有显著性差异（P<0.05）；D组与C组比较有显著性差异（P<0.01）    2. 24h荧光显微镜下各组细胞内绿色荧光蛋白表达效果（×400）    讨论    目前将外源基因转入靶细胞的方法主要有病毒载体转染、脂质体转染及一些物理方法。由于病毒载体可引起免疫反应和改变靶细胞遗传特性等缺点限制了临床应用，脂质体虽为

13、一种较为安全的转染载体，但存在转染率较低和缺乏特异性的缺点，其它的转染方式转染率更低，因此希望寻找一种新的高效而安全的转染方法。近年来超声介导基因转染的研究取得了很大进展，国内外多项报道介绍了超声介导下转染各种体细胞、肿瘤细胞的实验研究，均有理想的转染效果23。进一步的实验表明：通过添加超声微泡造影剂，能在声压击破微泡的瞬间释放能量，产生细胞膜的“孔隙效应” （porosity），加强细胞的通透性，从而提高外源大分子物质进入靶细胞内，提高基因在靶细胞内的转染和表达4-7。进一步的动物实验模型也证实了超声介导能增强目标基因在肿瘤组织的转染8。    本实验发现：虽然

14、微泡造影剂SonoVue协同超声辐照能使荧光蛋白在肝癌细胞中表达，但转染效果却不如脂质体（P<0.05）。而当同时加入微泡造影剂和脂质体，并以超声进行辐照时，转染效果大大加强，分别与单独的脂质体转染、微泡造影剂+超声辐照转染有显著差异（P<0.05）。这些结果说明微泡造影剂协同超声作为一种新的转染方法，尚有许多待探讨的问题，如各项超声参数的优化、造影剂浓度等；各项报道的条件各不相同，缺乏统一公认的标准，因此以超声和微泡造影剂作为单独的基因载体效果尚不稳定，与稳定的脂质体转染效果尚不能相比。而脂质体转染是一种较为成熟的转染方法，同时加入微泡造影剂后，在超声的辐照下微泡破裂，提高了超声

15、对靶细胞的“孔隙效应”，使肝癌细胞膜的通透性增加，促使更多的脂质体携带荧光蛋白进入细胞内，从而使荧光蛋白在细胞内的表达也大大提高。同时，由于本实验只是单纯地将微泡造影剂与细胞溶液混合，造影剂微泡在超声辐照下破裂，所起的只是能量载体的作用，因此对基因的转染缺乏靶向性和稳定性。目前有报道正在研究靶向性造影剂，能达到高浓度结合或包裹目的基因，而后连接上能与组织细胞表面受体特异性结合的配体，这样将进一步提高基因的转染、表达和靶向性9。最近，还出现了一种纳米级微泡造影剂，有更好的细胞膜穿透力10，相信能进一步提高转染效果。超声辐照+微泡造影剂+脂质体是一种能提高目标基因在靶细胞内转染率的可行方法，通过不

16、断提高与完善，有望在对肝癌的基因治疗中发挥更大作用。    【参考文献】  1. 查锡良，刘德培，药立波. 医学分子生物学. 北京:人民卫生出版社,2005.218219    2. 李肖蓉，邵力正，王如兴,等. 超声介导白蛋白微泡破裂对外源性基因在ECV304细胞和BALB/c鼠心肌中的表达. 中华医学超声杂志（电子版），2006, 3 (2）：69-72    3. Azuma H, Tomita N, Kaneda Y, et al. Transfection

17、 of NFkappaB-decoy oligodeoxynucleotides using efficient ultrasound-mediated gene transfer into donor kidneys prolonged survival of rat renal allografts. Gene Ther, 2003, 10(5): 415-425    4. Bekeredjian R, Chen S, Frenkel PA, et al. Ultrasound-targeted microbubble destruction ca

18、n repeatedly direct highly specific plasmid expression to the heart. Circulation, 2003, 108(8): 1022-1026    5. Chen S, Shohet RV, Bekeredjian R, et al. Optimization of ultrasound parameters for cardiac gene delivery of adenoviral or plasmid deoxyribonucleic acid by ultrasound-targeted microbubble destruction. Am Coll Cardiol, 2003, 42(2): 301-308     6. Christiansen JP, French BA, Klibanov AL, et al. Targeted tissue transfection with ultrasound destruction of plasmid-bearing cationic microbubbles. Ultrasound Med Biol, 2003, 29(12): 175