抗p16单克隆抗体的制备及鉴定

1、    抗p16单克隆抗体的制备及鉴定        摘要目的：制备抗p16单克隆抗体并进行鉴定。方法:以p16合成肽为抗原免疫纯系小鼠。利用杂交瘤技术制备单克隆抗体，并利用亲和层析等法纯化抗体。通过酶免疫测定及免疫印 迹等法对单克隆抗体进行分析及鉴定，并通过免疫组化方法与进口多克隆抗体进行比较。结果：获得4株稳定分泌抗p16单克隆抗体杂交瘤株，与进口多克隆抗体比较，检测阳性及阴性 符合率达100。但使用单克隆抗体时，组织切片不需进行抗原修复，染色效果稳定。结论：抗p16单克

2、隆抗体的获得弥补了国内p16检测试剂的空白。关键词p16单克隆抗体多克隆抗体Preparation and Characterization of Monoclonal Antibodies against p16 Wan Wenhui Wang Qing Li Zhenpu et al(School of Oncology, Beijing Medical University, Beijing Cancer Hospital, Beijing)Abstract Objective: To prepare the monoclonal antibodies (McAbs) against p

3、16 and to characterized the McAbs. Methods: Balb/C mice were immunized with polypeptide fragment of p16 as antigen. Hybridoma technique was used to prepare McAbs agaist p16, and affinity chromatography was used to purify the McAbs. The McAbs were analysed and characterized with EIA and Western Blot

4、et al. and were compared with imported polyclonal antibodies (PoAbs). Results: Four hybridoma cell lines which stably secrete McAbs against p16 were got. There was a complete correspondence between the McAbs and imported PoAbs. Conclusion: The McAbs have high specificity and sensitivity. In addition

5、, the prepared monoclonal antibodies against p16 make up the blank space of domestic test reagent. Key Words p16 Monoclonal antibody Polyclonal antibodies ?1994年以来，关于p16抑癌基因及其产物在多种肿瘤细胞株及人肿瘤组织中表达的研究提 示，p16与肿瘤发生、发展及预后有密切关系。p16基因失活的最常见形式为纯合缺失和DNA 甲基化，其表现形式为p16蛋白缺失1。因此，可用免疫组织化学(IHC)方法直接检测p16 蛋白的表达水平。当前，

6、进行p16蛋白IHC测定所用的抗p16抗体均为兔抗p16多克隆抗体(PoAbs)。国内实验室多用进口PoAbs试剂盒，价格昂贵，性质亦不稳定。尚未见使用单克隆抗体 (McAbs)的报道。本研究以p16合成肽为抗原制备了鼠抗p16McAbs，应用于IHC检测，与进口PoAbs进行了比较。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 p16合成肽与试剂p16C末端第132148位17个氨基酸由美国QCB.Inc合成。氨基酸序 列为：H2NCSNHARIDAAEGPSDIPDCOOH。其中，胱氨酸(C)是一为偶联特别构成的氨基酸。 所用免疫化学试剂及胎牛血清等分别为美国Sigma、Gibco、Vector及

7、瑞典Pharmacia等产品 ，兔抗p16PoAbs(CatSC468、SC759)为美国Santa Cruz公司产品。1.1.2 细胞及实验动物人胃癌细胞系MGC803及小鼠骨髓瘤细胞SP2/0分别由本所细胞室及 免疫室惠赠，BALB/C小鼠及昆明小鼠由本所动物室提供，p16阴性细胞株及人骨肉瘤细胞US2 OS来源于美国ATCC。1.1.3 病例与标本阑尾组织以及乳腺癌、结直肠癌、食管癌及其断端正常组织共30例石蜡 切片标本，均经本所病理科诊断证实并提供。1.2 方法1.2.1 抗原的制备将p16合成肽与载体蛋白KLH偶联，方法参见文献2。 1.2.2 免疫、细胞融合及克隆化免疫及细胞融合均

8、按常规方法进行。经HAT选择性培养， 取细胞克隆生长孔上清，进行酶联免疫吸附测定(ELISA)以及对正常阑尾组织IHC检测，筛选 出双阳性孔，以有限稀释法进行克隆，经3至4次克隆，选择出单克隆分泌抗p16合成肽抗体 的杂交瘤细胞株。1.2.3 染色体计数按常规方法进行。1.2.4 ELISA以p16合成肽、或KLH、或BSA包被96孔板，余按常规方法进行。1.2.5 免疫细胞化学及IHC法(ABC试剂测定) ?按常规方法进行，结果判断以细胞核及胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性。1.2.6 制备富含McAbs的小鼠腹水及McAbs的纯化按常规方法制备腹水。以50饱和硫酸铵 沉淀(盐析法)及Protei

9、nASepharose CL4B柱(亲和层析法)对腹水进行纯化，然后，经PBS 透析浓缩，测定抗体浓度及活性，分装，20保存。1.2.7 McAb亚类鉴定将浓缩的无血清杂交瘤培养上清与兔抗鼠亚类抗体进行琼脂糖双向免 疫扩散。1.2.8 McAb的纯度及活性鉴定以10SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度，以间接ELISA鉴 定活性。1.2.9 McAbs叠加试验及McAbs识别抗原表位分析首先，以p16合成肽1g/ml、50l/孔包 被96孔板，取McAbs，按系列倍比稀释浓度加入各孔，进行间接ELISA，测定OD492nm值，绘 制抗原饱和曲线，确定反应达饱和点时各McAbs的浓度。其次，在p16

10、合成肽1g/ml、50l 孔包被的96孔板上，以达饱和点时抗体浓度，将两种抗体各50l同时加入一孔，进行间接E LISA，测得OD值，计算叠加指数(AI)3，若AI50，表明针对不同抗原表位。1.2.10 McAbs相对亲和力的测定方法参见文献4。1.2.11 免疫印迹(Western Blot)提取细胞总蛋白，经15SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ，进行电转移至硝酸纤维膜，将膜以3BSA封闭后，进行间接免疫酶染色，DAB显色。2 结果2.1 杂交瘤细胞株的建立经细胞融合及选择性培养，选取培养上清与p16合成肽及正常阑尾组织呈强阳性反应、与 KLH及BSA无反应的细胞，进行4次克隆后，获得4株分

11、泌抗p16合成肽抗体的单克隆细胞株， 分别命名为2B12、3B12、4B12及9F2。4株杂交瘤细胞染色体数目在86108之间。反复冻融 杂交瘤细胞，仍保持稳定分泌抗体。2.2 McAbs纯度及活性纯化后的McAbs经10SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，只有免疫球蛋白的轻、重链，表示纯化满意。经ELISA检测显示，抗p16McAbs培养上清效价高于103，腹水效价高于107，纯化后腹水1000g/ml，倍比稀释检测，效价高于105。2.3 McAbs的生物学性质鉴定2.3.14株McAbs的亚类均为IgG2型。2.3.2McAbs所识别的抗原表位检测4种McAbs两两叠加，共有6种组合，任何两种

12、抗体AI值 均小于50，表明具有竞争抑制效应，显示4种McAbs识别p16合成肽抗原的同一表位。2.3.34种McAbs亲和力相差不明显，依次为9F2>3B12>2B12>4B12。2.3.4McAbs的特异性1)ELISA测定显示，抗p16McAbs与p16合成肽抗原呈强阳性反应，而与KLH、BSA无交叉反应。2)免疫细胞化学染色显示，抗p16McAbs与MGC803具有阳性反应，而 与p16阴性细胞株及US20S无反应。3)WesternBlot结果显示，纯化的McAbs与MGC803提取总蛋 白电转移后的硝酸纤微膜反应，在分子量为16000处清晰地呈现一条着染线(1)。

13、1.低分子量标准2.与p16McAb(1:500)反应3.与p16McAb(1:300)反应4.与阴性对照正常鼠血清1McAb对应抗原的免疫印迹分析2.3.5与进口抗p16PoAbs的比较以自制McAbs与两种进口PoAbs分别对正常阑尾、乳腺癌、 结直肠癌、食管癌及断端正常组织石蜡切片进行免疫组化染色，镜下显示，在断端正常组织 、癌旁组织、部分或全部肿瘤组织细胞的胞核及胞浆内均可见棕色颗粒，淋巴细胞无着染， 阳性及阴性结果完全相符。但是，自制McAbs对于无论作过抗原修复或未经抗原修复的组织切片染色无差别，而进口多抗(SC486及SC759)对未经抗原修 复的切片阳性染色不明显，只对进行抗原

14、修复的切片着色力强(26)。抗p16McAb(9F2)为一抗。未经抗原修复，胞浆、胞核内可见棕色阳性反应颗粒。淋巴细胞染色呈阴性反应2正常阑尾组织IHC染色×400抗p16McAb(9F2)为一抗。经抗原修复3正常阑尾组织IHC染色×400抗p16PoAb(SC468)为一抗。经抗原修复4正常阑尾IHC染色×400抗p16PoAb(SC759)为一抗。未经抗原修复5正常阑尾组织IHC染色×400抗p16PoAb(SC759)为一抗。经抗原修复6正常阑尾组织IHC染色×4003讨论本研究以p16合成肽作为抗原，成功地建立了稳定分泌抗p16 McA

15、bs的杂交瘤细胞系，并对 McAbs的一般性质作了系统分析，特别是，以表达p16的人胃癌细胞系MGC803为抗原进行免疫 印迹鉴定，证明McAbs确实针对细胞内p16蛋白，p16合成肽确实与细胞内存在的p16抗原组成 成分相符。从而，肯定了此McAbs具备在细胞内检测p16表达的应用价值。对于原发肿瘤细胞中p16检测，最初多采用分子生物学方法，如PCR相关技术、Southern B lot、Northern Blot、Western Blot等，但由于肿瘤组织不可避免存在正常细胞，得到准确结 果较为困难。以上方法又不适合检测非遗传变异，并且，实验技术繁琐复杂。IHC不仅可避 免上述缺陷，还可检

16、测微小病灶内的p16表达，所需标本量小，简便易行，日益受到研究者 们的重视。目前，用于IHC法进行p16检测的试剂多为国外生产的兔抗p16 Po Abs。本室制备的 鼠抗p16 McAbs与其比较，IHC检测染色结果一致，阳性及阴性符合率为100，并且，使用自 制McAbs时，组织切片无需进行抗原修复，而进口PoAbs需进行抗原修复。这可能是由于此Mc Abs识别p16蛋白C末端17个氨基酸此部位抗原在石蜡切片制作过程中不易受到遮蔽的关系 。因此，简化了操作步骤、更具实用性。此外，进口PoAbs价格昂贵、效价也不够稳定。总之，抗p16 McAbs的获得弥补了国内p16检测试剂的空白，为进一步研

17、制p16临床检测试 剂盒奠定了良好的基础，并为p16表达的研究创造了条件。(范锡凤 校对)本文课题受北京市科学技术委员会科研基金资助 作者单位：万文徽北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院(北京市100036)王青北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院(北京市100036)李振甫北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院(北京市100036)高学硕北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院(北京市100036)鄂征北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院(北京市100036)蔡红北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院(北京市100036)参考文献1Tam SW,Shay J W,Pagano M,et al. Di

18、fferential expression and cell cycle regulation of cyclin dependent kinase 4 inhititor p16Ink4. Cancer Res,1994;54:58162Sambrook J,Fritsch E F ,Maniatis T. Molecular Cloning,Second edition,Cold Spring Harb or Laboratory Press,1989;18:83Friguet B,Djavadi Ohaniance L,Pages L,et al. A convenient enzymlinked immunosortent assay for testing whether monoclonal antitodies recognize the same ant