抗氯霉素单克隆抗体4D10的特性鉴定

1、抗氯霉素单克隆抗体4D10的特性鉴定                             作者：林月霞，段涛，董斌，袁茵，田素娟【摘要】  目的 对抗氯霉素单克隆抗体4D10进行纯化与特性鉴定，以获得可用于检测氯霉素残留试剂盒的单克隆抗体。方法 用两步硫酸铵法和G蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体，用间接酶联免

2、疫吸附试验、竞争ELISA等方法测定抗体效价、特异性、敏感性与亲和性以及抗体与其它氯霉素结构类似物的交叉反应率。结果 纯化后抗体的纯度高达95%;对抗体进行相关性质的鉴定得出：4D10效价为12.56×105，其亲和力常数可达2×108M-1，该抗体与CAP?BSA，CAP?OVA有反应，与BSA、OVA无反应;与氯霉素琥珀酸钠、氯霉素反应，而与其它氯霉素结构类似物无交叉反应。结论 抗氯霉素单克隆抗体4D10效价高、特异性强、亲和力高，可利用该抗体制备检测氯霉素残留的ELISA试剂盒。 【关键词】  氯霉素;单克隆抗体;亲和常数(School of Life Sc

3、iences and Biopharmaceutics，Guangdong Pharmaceutical College，Guangzhou,Guangdong 510006,China)Abstract:Objective To prepare and to characterize the monoclonal antibody (McAb) against chloramphenicol (CAP). The McAb was used for the kit of detecting chloramphenicol residues.Methods Two?step ammonium

4、sulfate precipitation and protein G purification by affinity chromatography were used to purify McAb. Competitive inhibition enzyme linked immunosorbent assay (ciELISA) was used to determine the antibody titer and competitive ELISA was used to determine specificity,sensitivity,affinity,and the cross

5、?reactivity between the antibody and chloramphenicol analogs.Results The purity of the antibody was 95%,the titer of McAb 4D10 was 12.56×105,its affinity was 2×108 M-1,and it had no reactivity with BSA,OVA and the chloramphenicol analog.Conclusion McAb 4D10 had high titer,high specificity,

6、and high affinity,and could be used to develop CAP immunoassay kits for detection of CAP residues.Key words:chloramphenicol (CAP); monoclonal antibody; affinity氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一种针对革兰阳性和阴性菌以及其他微生物的广谱抗生素，被广泛运用于畜牧业。然而，氯霉素具有较强的毒副作用，尤其是严重的再生障碍性贫血，且在动物中消除速度慢，残留的氯霉素可通过食物链传给人类，对人类的健康造成危害。动物食品中的氯霉素残

7、留对人类的健康构成了巨大威胁，这一问题已引起国际组织和许多国家和地区的高度重视，包括欧盟在内的许多国家已禁止其在食品生产、动物中使用1。氯霉素残留ELISA检测法具有灵敏度高、特异性强、分析成本低以及样品前处理简单等优点，是目前较理想的残留筛选分析方法之一2。合格的氯霉素(CAP)单克隆抗体是CAP残留ELISA检测法建立的前提，本研究对本室制备保存的抗氯霉素单克隆抗体4D10进行纯化，并对该单抗的相关性质进行鉴定。有关4D10单抗的一般性质如相对分子质量、纯度、抗体亚类、染色体、效价等已在另文发表3，本文主要对该单抗的敏感性、特异性和亲和力等方面的性质进行鉴定，为制备氯霉素残留ELISA试剂

8、盒提供高效、优质的原材料。1 材料与方法1.1 材料抗氯霉素单克隆抗体4D10、OVA?CAP包被抗原为本实验室制备保存3-4;氯霉素标准品(CAP)、卵清蛋白(OVA) 、氯霉素琥珀酸钠、磺胺二甲基嘧啶、甲砜霉素为Sigma公司产品;青霉素等抗生素为广州威佳科技有限公司产品;酶标二抗羊抗鼠IgG为Santa进口分装产品;其他试剂均为市售所得，AR级。1.2 方法1.2.1 4D10单克隆抗体的纯化 将-80保存的单抗融化后，用两步硫酸铵法和G蛋白亲和层析法纯化单抗。操作流程参考文献5。1.2.2 单抗4D10敏感度鉴定 根据方阵法筛选出最佳包被抗原质量浓度(5.0 g/mL)和单抗稀释倍数(

9、132 000)，用ciELISA法测定单抗与倍比稀释的系列浓度CAP作竞争反应，测定A450值并计算抑制率。抑制率计算公式：抑制率=(B0-B)/B0 ×100%;阴性A450值为B0，各CAP浓度对应的A450值为B;以抑制率为纵坐标，以lgCAP为横坐标，利用Microsoft Excel做(B0-B)/B0%-lgCAP拟合曲线，并利用拟合的标准曲线计算半数抑制率IC50，以10%20%抑制率所对应的CAP浓度为其敏感度。1.2.3 单抗4D10与包被抗原的交叉反应性 通过间接ELISA法测定单抗4D10与OVA、CAP?OVA、BSA、CAP?BSA的交叉性，包被抗原质量浓

10、度分别为5 g/mL的OVA、CAP?OVA、BSA、CAP?BSA，加入纯化后作一定稀释度的抗体。1.2.4 单抗4D10与各抗生素类似物的交叉反应性 配制各种比例的抗生素类似物(氯霉素琥珀酸钠、磺胺二甲基嘧啶、甲砜霉素、链霉素、庆大霉素、苯丙氨酸、四环素等类似物)，通过竞争ELISA法测定抗体4D10与各抗生素类似物的交叉性，根据公式计算交叉率。交叉率(CR)=IC50(McAb?CAP)/IC50(McAb?怖嗨莆?)×100%1.2.5 单抗4D10的亲和常数测定 以3个不同质量浓度的CAP?OVA(2.5 g/mL、5 g/mL、10 g/mL)包被酶标板，并将纯化后的单克

11、隆抗体倍比稀释，利用Batty饱和法进行测定。分别以抗体浓度Ab为横坐标，以各浓度所对应的A450值为纵坐标，绘制“S”型曲线。以曲线上趋于平坦段的A450值为100%，在曲线上算出50%A450值对应的抗体浓度，按照公式Ka=(n-1) / 2 × ( n Ab - Ab t ) 计算Ka。Ab: 表示抗原浓度为Ag时A=1/2Amax对应的抗体浓度;Ab t:表示抗原浓度为Agt 时A=1/2 Amax对应的抗体浓度; Ag /Agt: 表示抗原浓度;n:表示抗原Ag与Ag t 间的稀释倍数。2 结果2.1 单抗纯度及效价经过纯化后的单抗纯度达95%，效价为12.56×

12、105，可用于制备检测氯霉素残留试剂盒。2.2 单抗敏感度鉴定采用改良竞争ELISA法对4D10进行敏感性测定，并绘制标准曲线，计算其IC值，标准曲线图见图1。经计算可得，4D10 的IC50为14.29 ng/mL，其灵敏度即IC20为0.65 ng/mL。表1 4D10单抗敏感性测定2.3 单抗与包被抗原的交叉反应性通过间接ELISA法测定单抗与OVA、CAP?OVA、BSA、CAP?BSA的交叉性，结果显示4D10单抗与OVA、BSA无交叉反应，与CAP?OVA、CAP?BSA有显色反应(见表2)。表2 单抗与包被抗原的交叉反应2.4 单抗与各抗生素类似物的交叉性利用改良竞争ELISA法

13、测定单抗与各抗生素的交叉反应，抗氯霉素单克隆抗体4D10与氯霉素琥珀酸钠有交叉反应,而与苯丙氨酸等结构类似物基本无交叉所。见表3。表3 McAb 与相关化合物及抗生素的交叉反应2.5 单克隆抗体亲和力鉴定亲和常数反映了抗体的亲和力，一般认为亲和常数为1071010 M-1,抗体亲和力高，亲和常数为105106 M-1 ，亲和力低。根据公式计算可得：4D10的亲和常数为2×108M-1，亲和力较高，适合用于ELISA的检测(见图2)。3 讨论评价实验室制备的单克隆抗体的好坏，就必须对单克隆抗体进行系统的鉴定，包括对单克隆抗体一般性质如分子量、纯度、抗体亚类、染色体、效价等作出鉴定，更重

14、要的是对单抗的敏感性、特异性和亲和力等方面的性质作鉴定。根据单克隆抗体与抗原结合特异性强的特点，本实验对抗氯霉素单克隆抗体4D10进行特异性分析结果显示，该抗体对载体蛋白OVA、BSA无交叉反应，而与包被抗原CAP?BSA、CAP?OVA有较强的交叉性，说明该单克隆抗体针对的位点是氯霉素(CAP)，而并非BSA或OVA。单克隆抗体4D10对氯霉素琥珀酸钠有较强的交叉率(143%)，这是由于包被抗原的偶联是利用氯霉素半琥珀酸酯为母体而实现的，与相关文献报道相符6。单克隆抗体与甲砜霉素等氯霉素结构类似物均无交叉反应，说明该抗体特异性较强。单克隆抗体的亲和性以亲和常数的大小衡量。一般认为亲和常数为1

15、071010 M-1,抗体亲和力高，亲和常数为105106 M-1 ，亲和力低7。本实验采用Batty饱和法进行测定，对抗体进行亲和力测定得出，该抗体的亲和力为2×108 M-1，说明该抗体的亲和力较高，满足氯霉素试剂盒制备的要求。本实验室制备的抗氯霉素单克隆抗体4D10纯度高，特异性强，亲和力高，可用于下一步氯霉素残留ELISA检测试剂盒的研制。【参考文献】  1 FERGUSON J,BAXTER A,YOUNG P,et al. Detection of chloramphenicol and chloramphenicol glucuronide residues in poultry muscle,honey,prawn and milk using a surface plasmon resonance biosensor and Qflex?k kit chloramphenicolJ.Analytica Chimica Acta,2005,529(1-2):109-113.2 张宇.氯霉素在动物体内的残留与检测J.民营科技，2007，18(1)：68.3 林月霞，董斌，袁茵，等.抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备及筛选J.广东