打点杂交及RNA酶保护分析法检测反义HSP90基因转染细胞中反义RNA的表达

1、    打点杂交及RNA酶保护分析法检测反义HSP90基因转染细胞中反义RNA的表达        关键词HSP90反义核酸打点杂交RNA酶保护分析法基因转染摘要目的:检测HSP90反义核酸转染细胞后反义RNA的表达。方法:采用打点杂交及RNA酶保护分析法。结果:HSP90反义核酸转染细胞AHSGC7901,AHSGC7901/VCR,AHHCC7402及AHEc109有HSP90反义RNA的表达。结论:HSP90反义RNA在AHSGC7901,AHSGC7901/VCR,A

2、HHCC7402及AHEc109细胞的表达,为进一步研究HSP90在细胞生物学中的作用建立了可靠的细胞模型。中国书资料分类号Q78Expression of antisense RNA in HSP90 antisense RNA transfected cells determined by dot blot and RNase protection assay Liu Xianling, Zhao Qingchuan, Guo Jiancheng, Xiao Bing, Fan Daiming （Institute of Digestive Disease, Xijing Hospital

3、, Fourth Military Medical University, Xian 710032） Keywords HSP90 antisense RNA Dot blot RNase protection assay Gene transfection Abstracts Aim：To determine the expression of antisense RNA of HSP90 in HSP90 antisense RNA transfected cells. Methods： Dot blot and RNase protection assay were employed.

4、Results： AHSGC7901,AHSGC7901/VCR, AHHCC7402 and AHEc109 cells transfected with HSP90 antisense RNA all expressed HSP90 antisense RNA.Conclusion:AHSGC7901, AHSGC7901/VCR, AHHCC7402 and AHEc109 express HSP90 antisense RNA. This provides a basis for the research of the biological roles of HSP90 in the

5、above cells. 反义核酸可封闭和抑制特定基因的表达，从而阻断该基因的功能。我们依据反义核酸的作用原理，从原始质粒phHSP90中酶切消化下一段HSP90基因片段，将其反向克隆入真核表达载体pcDNA3.1()，构建成真核表达载体pcDNAHSP90。以Lipofectamine介导基因转染，将pcDNA?HSP90分别转染入人胃癌细胞系SGC7901及其耐药细胞系SGC7901/VCR，以及人肝癌细胞系HCC7402及人食道癌细胞系Ec109。转染细胞经G418筛选后,获得稳定克隆AHSGC7901,AHSGC7901/VCR,AHHCC7402及AHEc109。应用打点杂交及RNA

6、酶保护分析法,检测了转染细胞HSP90反义RNA的表达。1材料和方法11试剂细胞裂解液异硫氰酸胍(Seva公司),柠檬酸钠(华美公司),Sarkosyl(Sigma公司），-32PATP（北京福瑞公司），T4噬菌体多核苷酸激酶（GIBCO公司），20×SSC（NaCl，柠檬酸钠），50×Denhardt聚蔗糖(华美公司)，聚乙烯吡咯烷酮(华美公司)，BSA(Sigma公司），预杂交液6×SSC，0.5SDS(Sigma公司），5×Denhardt，100g/ml鲑精DNA(Sigma公司），5×TBETris碱(华美公司)，硼酸，EDTA(华美

7、公司),5×杂交缓冲液(200mmol/LPIPES pH6.4,2mmol/L NaCl,5mmol/L EDTA),甲酰胺杂交缓冲液甲酰胺(华美公司):5×杂交缓冲液=41,RNase S1(Sigma公司）,RNase S1 buffer(10mmol/LTris?ClpH7.5,300mmol/L NaCl,5mmol/L EDTA),RNA上样缓冲液80甲酰胺,1mmol/L EDTA pH8.0,0.1溴酚蓝,0.1Xylene Cyanol,42丙烯酰胺(华美公司),10过硫酸胺(华美公司)。12细胞系人胃癌细胞系SGC7901，从军事医学科学院毒物药物研究所

8、引入，其耐药细胞系SGC7901/VCR，由本研究所王少冬硕士提供，人肝癌细胞系HCC7402，从本校病理学教研室引入，人食道癌细胞系Ec109从本校生物化学教研室引入；HSP90反义核酸转染细胞AHSGC7901，AHSGC7901/VCR，AHHCC7402，AHEc109及pcDNA3.1()空载体转染细胞SGC7901pcDNA，SGC7901/VCRpcDNA，HCC7402pcDNA及Ec109pcDNA，由本研究所作者等转染。13探针的设计及合成从HSP90cDNA序列的第1641bp起，读取30个bp,即:5ATT GAC GAG TAC TGT GTG CAG CAG CTC

9、 AAG3。经上网与基因库中的基因分析,发现此序列仅与HSP90相同,未发现其与其它基因同源，故以此段基因序列作为探针，送上海生物工程公司合成。-actin探针由赵青川博士惠增,序列为-actin-2095：5-ATC ATG TTT GAG ACC TTCAA-3。14末端标记法标记寡核苷酸探针取10pmol/l寡核苷酸1.0l，加10×T4 Buffer 2.0l，10pmol-32PATP5.0l，加纯水至反应总体积为19.5l，混匀后,取出0.5l加入10l10mmol/LTris-Cl(pH8.0)中,用于测比放射活性。然后在原反应体系中，加入1lT4噬菌体多核苷酸激酶,混

10、匀,37温育45min,再置68°C水浴中10min，以灭活T4激酶。之后再取出0.5l加入到10l10mmol/LTris-Cl(pH8.0)中,用于测定比放射活性。最后对探针行乙醇沉淀,重溶于20l1mmol/LEDTA去离子水中,20°C保存备用。以TCA法测定寡核苷酸的比放射活性1。15RNA的提取分别收集1×106细胞，用PBS洗涤，加入异硫氰酸胍裂解液500l，3mol/LNaAc100l,水饱和酚及氯仿各500l,冰浴中置20min。于4°C离心（12000r/min）15min。取水相，加等体积的氯仿重新抽提1次。用异丙醇沉淀，4

11、6;C离心（12000r/min）15min。用70乙醇洗涤1次，沉淀溶于50lDEPC处理过的三蒸水中,于20°C储存，同时取少量做含量测定。16RNA斑点杂交取已定量的RNA样品，经甲醛变性后点样于硝酸纤维素膜，放于80°C烤箱烤2h。加预杂交液封口后，置于68°C中水浴2h。取出杂交袋，向预杂交液中加入探针，重新封口，在68°C中温育16h24h。取出杂交膜，放入2×SSC和0.1SDS液中,室温漂洗20min,再用0.2×SSC和0.1SDS液在68°C漂洗3次,每次10min。取出NC膜,用滤纸吸干水分,保鲜膜覆盖

12、,暗室中压上X光胶片,置?20°C曝光48h72h，取出X光片,冲洗胶片,观察结果。17RNase Protection Assay2取细胞RNA10g,加1.0×105cpm的32P标记的寡核苷酸探针及actin探针，加无水乙醇、糖原和3mol/L乙酸钠，于20放置20min，离心、乙醇洗涤、真空干燥，加30l甲酰胺杂交缓冲液重悬；85变性510min，37杂交过夜。加RNaseS1buffer2l,水16l,RNase S1 2l（2g/ml）,37消化1h；乙醇沉淀；加20l终止液（10SDS,20mg/ml蛋白酶K）3715min；酚/氯仿抽提、乙醇沉淀、真空干燥；

13、重溶于10lRNA上样缓冲液中，上样，做18聚丙烯酰胺/尿素凝胶电泳（200V,120min）和放射自显影。2结果21打点杂交分别提取pcDNAHSP90转染组、pcDNA3.1()转染组及空白对照组细胞的总RNA，经变性点膜进行斑点杂交。用同位素标记的actin探针(内参照)进行杂交。结果显示,3组细胞均有阳性信号（1）。用HSP90单链寡核苷酸探针杂交的结果显示，3组细胞中，仅转染pcDNA?HSP90的组有阳性信号（2），而转染pcDNA3.1()空载体组及空白对照组均未见有杂交信号，从而证明pcDNAHSP90已转染入细胞，并有反义HSP90 RNA的表达。1HSP90反义RNA转染细

14、胞AHSGC701，空载体转染细胞SGC7901pcDNA及其亲本细胞SGC7901中actin mRNA的表达Fig 1 The expression of -actin mRNA in 3 human gastric cancer cell lines 1: SGC7901; 2: SGC7901-pcDNA; 3: AH-SGC701 2打点杂交法检测HSP90反义RNA转染细胞、空载体转染细胞及其亲本细胞中HSP90反义RNA的表达Fig 2 The expression of HSP90 antisense RNA in pcDNA HSP90 transfected, pcDNA3

15、.1( ) transfected and the parental cell lines by Dot blot1： SGC7901; 2： SGC7901/VCR; 3： HCC7402; 4： Ec109 22保护分析法结果见3。由3可见HSP90反义核酸转染细胞AHSGC7901/VCR（1），AHSGC7901（4），AHHCC7402（7）及AHEc109（10）组有两条电泳带；转染pcDNAHSP90组及空白对照组（parental cell line）可见1条带。表明转染了pcDNA-HSP90的细胞可检测到反义HSP90 RNA的表达，进一步证明pcDNA-HSP90已转染入

16、细胞，并有反义HSP90 RNA的表达。3RNA酶保护分析法检测HSP90反义RNA转染细胞、空载体转染细胞及其亲本细胞中HSP90反义RNA的表达Fig 3 Expression of HSP90 antisense RNA by RNase Protection Assay M: PBR322 DNA/Hae Marker； C1: Positive control， actin(20bp) and HSP90 probe (30bp); C2:Negative contive control, probe plus RNase S1, no RNA。 1: AHSGC7901/VCR;

17、2: SGC7901pcDNA/VCR; 3: SGC7901/VCR; 4: AHSGC7901; 5:SGC7901pcDAN; 6:SGC7901; 7: AHHCC7402; 8:HCC7402pcDNA; 9: HCC7402; 10:AHEc109; 11:Ec109pcDNA ;12:Ec109 3讨论为了检测经G418筛选出的阳性克隆是否有HSP90反义RNA的表达，我们在上海生物工程公司合成了一段30个碱基的寡核苷酸，用(32P)ATP标记后，与G418筛选出的阳性克隆提取的RNA进行打点杂交，以pcDNA3.1()空载体转染细胞及亲本细胞RNA作为对照。结果表明,转染pcD

18、NAHSP90的细胞，打点杂交有阳性信号，pcDNA3.1()空载体转染组及空白对照组均无阳性信号，证明pcDNA?HSP90转染细胞有HSP90反义RNA的表达。RNase保护分析2,3或RNA作（RNase mapping）为一高度敏感的基因表达的分析方法。此方法最初用于对特异RNAs进行检测及定量，在基因特性研究中，用其决定外显子的大小。RNase保护分析的原理为：将标记的寡核苷酸探针与细胞总RNA或mRNA杂交，再用RNaseS1消化单链未杂交的RNA，则杂交的双链被保护而不被RNase S1消化。经丙烯酰胺/尿素凝胶电泳可分离出来，放射自显影后可显示杂交的条带；通过标准分子量marker可确定其大小。此方法可以测出0.1pg的globin RNA，其特异性及敏感性远远超过Northern杂交。我们进而用RNase Protection Assay检测了转染细胞及对照组细胞中HSP90反义RNA的表达。结果表明，pcDNA-HSP90转染细胞有HSP90反义RNA的表达。用RNase Protection Assay检测R