抗PML-RARα反义核酸对NB4细胞形态、PML-RARαmRNA及蛋白质表达的影响

1、    抗PML-RAR反义核酸对NB4细胞形态、 PML-RAR mRNA及蛋白质表达的影响        【摘要】目的探讨抗PML-RAR反义核酸（FUAS）对NB4细胞的分化、PML-RAR mRNA表达及PML/PML-RAR蛋白细胞内定位的影响。方法以NB4细胞为研究对象，细胞形态观察采用Wright染色法；PML-RAR mRNA表达采用RT-PCR法；PML/PML-RAR蛋白细胞内定位采用免疫荧光技术。结果FUAS处理后第5天，细胞出现部分

2、分化。处理后24，72，120小时，PML-RAR mRNA表达分别下降52.0%、68.7%、23.4%。抗PML抗体免疫荧光检测，FUAS处理24小时后，细胞内微小颗粒消失，残存颗粒变大，120小时细胞内颗粒几乎消失。结论FUAS特异性阻断PML-RARmRNA表达，使PML-RAR融合蛋白合成减少甚至消失，进而促进细胞分化。【关键词】基因，PML-RAR细胞系，NB4寡核苷酸类，反义 Effects of anti-PML-RAR antisense on cell morphology and expression of PML-RAR mRNA and protein of NB4

3、cellsCHEN Ye, MIAO Jinming, ZHU Xuehong, et al. Shanghai Institute of Hematology, Renji Hospital， Shanghai Second Medical University，Shanghai200001【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of anti-PML-RAR antisense (FUAS) on cell morphology, expression of PML-RAR mRNA and PML-RAR/PML protein loc

4、alization of NB4 cells. MethodsPML-RAR mRNA expression was assayed by RT-PCR and PML-RAR/PML protein localization by immuno-fluorescence. ResultsNB4 cells were partially differentiated after 5 days of FUAS treatment and typical apoptosis was found after 7 days incubation with FUAS. The expression of

5、 PML-RAR mRNA at 24h was already down regulated in FUAS-treated cells. After 24h, 72h and 120h incubation with FUAS, PML-RAR mRNA showed 52.0%, 68.7% and 23.4% reductions, respectively, as compared with that of control. Immuno-fluorescence analysis with anti-PML monoclonal antibody showed disappeara

6、nce of microgranules, residual granules becoming larger discrete dots at 24h of FUAS treatment and almost disappearence of dots at 120h. ConclusionFUAS specifically blocks the expression and translation of PML-RAR gene, makes the production of PML-RAR fusion protein decrease or disappear and prompts

7、 cell differentiation. 【Key words】Genes,PML-RARCell line, NB4Oligonucleotides, antisensePML-RAR融合蛋白通过干扰粒细胞分化、阻止粒细胞凋亡而导致急性早幼粒细胞白血病(APL)已被许多实验间接证实。关于 APL发生过程中，PML-RAR蛋白确切的分子作用机制仍不清楚。我们采用反义核酸(AS)技术，研究PML-RAR基因表达阻断后，NB4细胞的形态、PML-RAR mRNA表达及PML/PML-RAR蛋白细胞内定位的改变。材料和方法1细胞培养方法见文献1,4种寡核苷酸起始部位反义寡核苷(STAS)、融合部

8、位反义寡核苷酸(FUAS)、正义寡核苷酸(Sen)、随机寡核苷酸(Ran)以60g/ml的终浓度加入初始细胞浓度为5×104/ml的培养体系中，18小时后追加初始剂量的一半剂量，于孵育后不同时间收集细胞，进行检测，以不加寡核苷酸的空白作为对照。2细胞形态观察分别于寡核苷酸处理后3，5，7，9天收集细胞，用细胞涂片仪涂片，1000r/min离心3分钟。自然晾干后，常规Wright染色，显微镜下观察。3总RNA抽提及cDNA合成TRIzol总RNA抽提试剂盒和SuperScriptTM逆转录试剂盒购自Gibco公司，按说明书操作。电泳鉴定RNA的质量，紫外光分光光度计定量。取总RNA 1

9、g，随机引物1g，加入20l逆转录反应体系，内含200mmol/L dNTP，2.5mmol/L MgCl2，10mmol/L Tris-HCl(pH 8.4)，50mmol/L KCl，逆转录酶200U。25 10分钟，42 50分钟，70 15分钟，最后95 5分钟灭活逆转录酶。4筑巢式聚合酶链反应(Nest-PCR)5l cDNA用于扩增PCR，PCR反应体系50l，内含MgCl2 2mmol/L，Taq DNA聚合酶2.5U，dNTP 200mmol/L，KCl 500mmol/L，Tris-HCl 100mmol/L，pH 9.0，Triton X-100体积分数为1%，所有试剂购自

10、Promega公司，M2，M5引物各50pmol，95变性后，进行40个循环。循环条件：94变性 45秒，55退火 1分钟，72延伸 1分钟。最后延伸10分钟。取第一轮PCR产物5l进行第二轮PCR，除引物改为M2，M8外，余方法同前。另以-actin的扩增产物为内参对照。M2、M5、M8为目的基因PML-RAR的扩增引物2。扩增引物序列及扩增片段如下：M2：上游引物5-AGTGTACGCCTTCTC-CATCA-3；M5：下游引物5-CATAGTGGTAGCCTGAGGAC-3；M8：下游引物5-CAGAACTGCTGCTCTGGGTCTCAAT-3。M2M5扩增片段422bp,M2M8扩增

11、片段339bp。-actin上游引物5-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3；下游引物 5-GGATTGAACGCGTCTTCTT-3。扩增片段531bp。-actin引物委托上海Sangon公司合成，M2、M5、M8引物委托中国科学院植物所合成。5PCR产物定量取12l扩增产物在20g/L琼脂糖凝胶上进行电泳，以PCR Mark(华美公司)作为相对分子质量标准，电压110V，2小时。溴化乙锭染色，紫外反射仪上显影、照相。用扫描分析进行目的基因表达的半定量(以PML-RARcDNA/-actin cDNA的比值反映PML-RAR mRNA的表达水平)。6免疫荧光检测收集寡核苷酸处理

12、的细胞，细胞涂片机涂片，自然晾干。用PLP液4固定30分钟，PBS漂洗3次(PLP液：3份0.1mol/L赖氨酸溶液与1份体积分数为8的多聚甲醛溶液混合，加入终浓度为0.01mol/L的高碘酸钠)。加150抗PML抗体(PG-M3,Santa Cruz Bio-tecknology公司)于饱和湿度盒内、室温下孵育45分钟，PBS漂洗3次，加130的FITC标记的羊抗鼠IgG(华美公司)，于饱和湿度盒内、室温下孵育45分钟，PBS漂洗3次，自然晾干后荧光显微镜下观察、照相。结果1抗PML-RAR反义核酸处理后NB4细胞形态学的改变Sen组、Ran组细胞处理后第3，5，7，9天细胞形态与空白对照组

13、差异不明显。FUAS组NB4细胞处理后3天形态未见明显改变；第5天可见部分分化现象。瑞氏染色后表现为细胞核明显缩小，染色质浓缩，核仁减少甚至消失，胞浆增多，颜色由深变浅，颗粒减少，胞浆内可见空泡，个别呈分叶状；处理后第7，9天，NB4细胞显示凋亡的特征性改变，胞膜完整、核染色质固缩、细胞核碎裂、形成凋亡小体。2抗PML-RAR反义核酸处理后NB4细胞PML-RAR mRNA表达情况NB4细胞经寡核苷酸处理后，PML-RAR mRNA的表达见1。Sen组、Ran组与空白对照组差异无显著性；FUAS处理组，PML-RAR mRNA表达24小时时即明显减少，持续到72小时。处理后24，72，120小

14、时PML-RAR mRNA表达分别下降52.0%、68.7%、23.4%。<"0701 (6624 bytes)" src="/med/cano/201003/20100317180407750" 245 109>1：未处理组；2：FUAS组；3：Sen组；4：STAS组；5：Ran组；610：为15的-actin内参照14种寡核苷酸处理后24小时NB4细胞PML-RARPCR扩增产物电泳3PML-RAR反义核酸处理后NB4细胞PML-RAR融合蛋白含量及PML/PML-RAR细胞内定位的变化用抗PML抗体进行免疫荧光检测，空白对照组NB4细

15、胞株为微小的颗粒弥散分布，颗粒超过100个，布满整个细胞；Sen组、Ran组细胞与空白对照组差异无显著性；FUAS组，24小时后细胞内微小颗粒消失，残存的颗粒变大，呈散在的点状颗粒，72小时细胞内点状颗粒减少，有的完全消失，120小时细胞内颗粒几乎完全消失。讨论我们的研究结果进一步表明：FUAS明显减少PML-RARmRNA和PML-RAR融合蛋白的表达，提示针对PML-RAR融合部位的AS能抑制PML-RAR基因的表达。AS抑制癌基因表达，发挥生物学效应的可能机制是：物理阻断：反义核酸(DNA或RNA)与靶基因或mRNA结合，阻断核糖体结合，干扰相应基因的转录、翻译；核糖核酸酶H(RNase

16、 H)激活：反义核酸DNA与mRNA结合，激活RNase H,剪切杂交分子中mRNA；阻断mRNA拼接：反义核酸与前mRNA结合，抑制正常成熟mRNA的拼接；改变mRNA的二级结构：AS与mRNA结合，mRNA二级结构改变，RNA降解加速3。正常的PML与其它至少5种蛋白质共同组成一个巨大的分子结构，称POD结构，形态上呈散在的点状分布，每个细胞约1020个颗粒4；由于PML-RAR融合蛋白的存在，APL细胞PML不定位于POD结构，POD结构解体，呈微小的多颗粒弥散分布4；NB4细胞株经全反式维甲酸（ATRA）处理后，POD结构重新装配，恢复其正常分布。PML-RAR融合蛋白破坏了PML结构

17、的完整性，干扰了5种蛋白质的功能，使得APL的细胞分化受阻。我们用免疫荧光技术检测AS处理后NB4细胞株PML和(或)PML-RAR的细胞内定位。空白对照组及 Sen组、Ran组细胞呈微小的多颗粒分布；FUAS处理后24小时，呈散在的点状分布，恢复正常的POD结构。结果与ATRA诱导的APL细胞或NB4细胞的改变一致，说明POD结构的完整性对细胞分化、成熟及其凋亡十分重要。PML-RAR不参与POD结构形成的原因，可能是由于PML-RAR与PML形成异源二聚体，掩盖了PML中某一结构，使之丧失与POD相关蛋白结合的能力。最近，Raelson等5报道，ATRA通过蛋白酶水解，下调PML-RAR融

18、合蛋白，不影响PML-RARmRNA表达及蛋白质翻译，PML-RAR融合蛋白下调的同时，RAR及PML并不下调。推测ATRA是由于诱导PML-RAR融合蛋白降解，PML/PML-RAR比例下降，从而恢复PML的正常分布。FUAS恢复NB4细胞株的正常POD结构，则是因为阻断了PML-RAR mRNA表达和翻译，使PML-RAR融合蛋白合成减少所致。众多实验研究表明， PML-RAR基因以阻断细胞分化和细胞凋亡的双重效应参与APL的发病。 PML-RAR融合基因转染造血祖细胞和非造血细胞6说明PML-RAR能干扰正常细胞分化,诱导细胞凋亡，提示 PML-RAR基因阻断后细胞即出现生长阻滞，并进入

19、分化程序。 APL细胞PML-RAR的表达大大超过野生型PML和RAR表达，有证据表明，PML-RAR融合蛋白与野生型PML、RAR蛋白的比率可能是其维持显性负效应、阻断粒细胞分化的关键7。PML-RAR扣押或阻断了残存正常的PML、RAR的功能，异常PML-RAR融合蛋白的减少则可解除显性负效应。FUAS首先降解PML-RAR mRNA，使PML-RAR融合蛋白合成减少，降低PML-RAR与野生型PML、RAR蛋白的比例，恢复APL细胞正常的POD结构，然后细胞开始分化。我们采用FUAS直接阻断PML-RAR基因表达，结果证明，PML-RAR基因产物干扰了NB4细胞株的正常生长周期和分化功能

20、。参考文献1陈烨，缪金明，朱学宏，等. 抗PML-RAR反义核酸的设计合成和对NB4细胞生长、凋亡的影响. 中华血液学杂志，1999，20：302-305.2Perego RA, Marenco P, Bianchi C,et al. PML-RAR alpha transcripts monitored by polymerase chain reaction in acute promyelocytic leukemia during complete remission,relapse and after bone marrow transplantation. Leukemia,1996，10:207-212.3Helene C.Control of oncogene expression by antisense nucleic acid. Eur J Cancer, 1995，31:1721.4Weis K, Rambaud S, Lavan C, et al. RA regulates aberrant nuclear localizat