异基因造血干细胞移植患者外周血TCR Vβ亚家族克隆性增殖动态变化及其与GVHD的关系(1)

1、    异基因造血干细胞移植患者外周血TCR V亚家族克隆性增殖动态变化及其与GVHD的关系(1)    】 本研究观察异基因造血干细胞移植(alloHSCT)患者外周血T 细胞受体（TCR） V亚家族克隆性增殖的动态变化，分析T细胞的克隆性演变与GVHD的关系。利用RTPCR方法扩增70例次alloHSCT后患者（其中17例次出现GVHD）外周血单个核细胞中24个TCR V基因的互补决定区3（CDR3），PCR产物经荧光标记和基因扫描分析CDR3长度, 确定T细胞的克隆性。结果表明：移植患者T细胞增殖一般都经历由

2、单克隆向多克隆演变的过程，在移植后60-90天时，逐渐由单克隆转为单克隆和多克隆表达大致各占一半。120天以后，无GVHD患者大多转为多克隆性表达；而GVHD患者受免疫抑制剂和GVHD的影响，直到1年以上仍有部分呈单克隆表达趋势。GVHD患者发生GVHD或靶器官受累最明显的时候，外周血TCR V亚家族的表达主呈现单/双克隆的表现，而经过免疫抑制治疗病情好转后，部分患者出现由寡克隆表达转为多克隆增殖趋势。结论：移植后早期患者尤其是合并GVHD的患者，T细胞呈克隆性增殖和T细胞受体的倾向性利用；随着造血和免疫的恢复，TCR V亚家族表达重新恢复趋向正常的多克隆性演变。 【关键词】 造血干细胞移植&

3、#160;   Clonal Kinetic Proliferative Change of TCRV Subfamilies in Peripheral Blood of Patients Transplanted with Allogeneic Hematopoietic Stem Cells and Its Relation to GVHD    Abstract    This study was purposed to investigate the dynamic chan

4、ge of clonal proliferation of T cell receptor V subfamilies in peripheral blood of patients received allohematopoietic stem cell transplantation (alloHSCT) and to analyze the relationship between T cell clonal proliferative changes and GVHD. The peripheral blood mononuclear cell samples from 70 case

5、s (17 GVHD patients) undergoing alloPBCST patients were detected for CDR3 (complementarity determining region 3 repertoire analysis of T cell receptor Vgene) using reversetranscriptasepolymerase chain reaction (RTPCR)The products were further analyzed by genescan to identify T cell clonalityThe sesu

6、lts showed that the patients of HSCT generally passed through a transformation from monoclone to polyclone. At day 60-90 after HSCT, half of the cases were monoclonal and the remainders were polyclonal. After 120 days, most of patients without GVHD transferred into polyclones, however, patients with

7、 GVHD remained monoclonal after one year because of immunosuppressive agents and GVHD itself. The peripheral blood of GVHD patients mainly expressed monoclone/biclone at the time of target organ damage conspicuously, after medication intervention, partial monoclone or bioclone expressed TC

8、R V subfamilies were diverted to polyclonal expression. It is concluded that the T cells present clonal proliferation and T cell receptors are prone to be used when patients are in earlier period of transplantation or with GVHD especially.    The expression of TCR V sub

9、families can return to normal polycloning along with the recovery of hematopoiesis and immunity in patients.    Key words    haemopoietic stem cell transplantation; GVHD; T cell receptor V subfamily; T cell clonality; genescan    T淋巴细胞的活化需两

10、个信号：第一信号通过T细胞受体（TCR）抗原多肽MHC复合物，此过程是受MHC限制的；第二信号是由多种共刺激分子提供。TCR 链V区基因亚家族分布和克隆性分析是了解肿瘤性或抗原特异性T细胞以及免疫功能重建情况的重方法。TCR在重排的过程中，不同克隆所形成的抗原受体互补决定区3 (complementary determining region 3, CDR3)的长度和碱基序列的不同1,决定了TCR的特异性。应用RTPCR基因扫描方法分析TCR V 24个亚家族的CDR3长度，是目前检测T细胞克隆性的一种比较灵敏和精确的方法2。我们应用此法动态地观察了异基因造血干细胞移植（alloHSCT）患者

11、外周血T细胞增殖的克隆性演变，并分析其与GVHD发生的关系。    材料和方法    病例选择    选取我院行异基因造血干细胞移植术的急性、慢性白血病患者27例，其中急性白血病15例，慢性粒细胞白血病12例，男性21例，女性6例，年龄为16-50岁，平均年龄28.9岁。分别采集移植前、移植后30、60、90、120和180天的外周血或采集物，共计106例次标本（经2MG检测后可以使用的标本为70例次），其中急性GVHD 13例次，慢性GVHD 21例次，无GVHD 47例次

12、。GVHD的诊断和分级标准符合西雅图Fred Hutchinson肿瘤中心的分级法3。70例次标本中：移植前标本8例次，采集的移植物12例次，发生GVHD的标本17例次（急性GVHD 6例次，慢性GVHD 11例次），移植后无GVHD的标本33例次，另有5例健康献血者作为对照。17例GVHD患者的一般临床情况见附表。    单个核细胞分离    收集患者外用血，肝素抗凝。用淋巴细胞分离液（Ficoll，密度1.077）离心分取单个核细胞层，用PBS重悬离心洗涤2次，取TRIzoL液1 ml，吹打至无沉淀，加入EP管

13、，置于-80冻存备用。    RNA提取及cDNA合成    将已加入TRIzoL试剂冻存的细胞解冻，采用酚氯仿异戊醇提取法提取RNA4-6，按TaKaRa RNA PCR Kit AMV Ver 2.1 试剂盒说明书进行cDNA合成反应。总反应体积为20 l，其中含5 l RNA模板，2 l dNTP （包括dATP，dCTP，dGTP和dTTP），0.5 l RNA酶抑制剂（RNase Inhibitor），1 l AMV 逆转录酶(AMV reverse Transcriptase)，30 10分钟, 42

14、30分钟，99 5分钟 ，5 5分钟,结束后以人的2MG 做为内参照检测cDNA。    反转录多聚酶链反应（RTPCR）    根据V 24个亚家族基因设计相应的24个V特异性上游引物，并在C区设1个C下游引物，引物均由德国柏林TIB公司合成5,6。 每一标本分别以V 124/C 24对引物进行24次PCR检测。PCR操作按已报道方法进行7。            作者：贾新颜,王健民,李扬秋,

15、陈少华,章卫平,陈莉【摘】本研究观察异基因造血干细胞移植(alloHSCT)患者外周         本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。    总反应体积为20 l，含1 l cDNA、其中含2 l dNTP （包括dATP，dCTP，dGTP和dTTP），V引物和C引物各1 l，2 l MgCl2, 0.2 l Taq 聚合

16、酶和PCR缓冲液。共进行40个循环，94 1分钟（首次3分钟），60 1分钟，72 1分钟（末次10分钟），结束后保存于4中。各反应均设阳性和阴性对照。PCR扩增产物于2.0%琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）中电泳分析结果（图1）。    Figure 1. PCR production electropherogram    of T cell receptor V subfamilies . T细胞克隆性分析    荧光标记PCR产物 该反应主是将首次TCR V PCR阳性产物

17、标上荧光素，进行不对称PCR扩增，10 l的反应体系含2.5 l的未标记的PCR产物、1.5 l Cfam 引物3、1 l MgCl2, 2.8 l dNTP, 0.2 l Taq 聚合酶和PCR缓冲液。PCR共进行35循环，退火温度为66，余条件同上。    基因扫描样品的配制及电泳处理（CDR3长度分析） 有关操作步骤按3100遗传分析仪使用指南 (ABI,Perkin Elmer公司生产)进行。荧光素标记的PCR产物（2L）加入2.5 l甲酰胺，0.5 l Genescan500 Tamra 分子量标准品 (ABI, Perkin Elmer，其中

18、含有不同大小的荧光标记的DNA片段)和0.5 l加样缓冲液(dextran 50 mg/ml, EDTA 25 mmol/L, Genescan500 Tamra Kit)，灌胶后样品于94变性4分钟，立即放置冰上冷却2分钟。变性后的样品装载到3100遗传分析仪进行电泳。电泳过程中CCD检测器把荧光信号转换为电信号并传送给3100数据采集软件工作站进行数据处理，并以电泳信号图的形式显示出来。电泳信号图的X轴表示时间，Y轴表示相对荧光强度，电泳信号图中的每个峰代表一个DNA片段。        基因扫描分析荧光产物

19、完成处理的数据被自动地从数据库中提取，经373A DNA序列仪（ABI, Perkin Elmer公司）的基因扫描672分析软件分析产物的长度和荧光素强度。其原理是检测不同时点通过扫描探头的荧光素（标记于PCR产物上），如果所检测的PCR产物大小一致，则在同一时间通过扫描探头，形成单峰图象，提示该PCR产物所对应的样本中CDR3区长度完全相同，即单克隆T细胞的特点。反之，如果PCR产物大小不一致，则电泳迁移速度不同，通过扫描探头时间不同形成了多峰图象，即代表多克隆情况。若出现一主峰或双峰图象，则分别代表寡/单克隆或双克隆情况（图2,3）。    Figu

20、re 2. Peak shapes in genescan. A: oligoclonal;B: polyclone.Figure 3. Four kinds of figure in genescan. 结    果    Genescan 技术对外周血T淋巴细胞TCR CDR3长度的分析    正常献血者各V亚家族谱型大多呈现多个峰的多克隆表现，即呈正态分布7。与正常献血者不同,17例GVHD患者中多数（16/17，占94.1）外周血部分V亚家族T细胞呈寡克隆、双克隆及不

21、同趋势的克隆性增殖，表现为单一主峰（寡克隆）或双主峰（双克隆）图象(图4)，以V13克隆性增殖最常见。    Figure 4. Analytic result of PCR production genescan from GVHD patients.    Note: The results of genescan analysis for PCR products from 17 patients with GVHD: 16 TCR V subfamilies （94.1） could be found to

22、 be oligoclone or biclone expansion,which show dominant peaks or bipeak. TCR V13 is the most frequent subfamily ,which is found in 11 out of 17( 64.7）and then V10 and V10 can be found in 5 patients, respectively.移植后患者TCRV亚家族的动态变化    移植前患者TCR V亚家族的表达 在8例移植前的标本中

23、，共有5例为ALL患者，其主特征为TCR V亚家族呈单克隆性增生：尤其是V1亚家族，5例中有4例呈单克隆增生（表达率为80），V10及V7中共有5例为阳性结果表达，且全部为单/双克隆性增生。    移植后30天的TCR V亚家族的表达 在10例移植后30天的标本中，有8例为无GVHD患者，其主特征为TCR V亚家族单克隆性增生,以V1、V13、V14最为显著。    移植后60天的TCR V亚家族的表达 在11例移植后60天的标本中，有3例为GVHD患者，8例为无GVHD患者，两组病人的主特征是阳性表达的TCR V

24、亚家族中单克隆和多克隆的表达各占一半（单/双克隆多克隆1620）。呈现单克隆向多克隆逐渐恢复的倾向。    移植后90天的TCR V亚家族的表达 在7例移植后90天的标本中，有1例为GVHD患者,6例为无GVHD患者，两组病人的主特征大致同60天时的情况，即阳性表达的TCR V亚家族中单克隆和多克隆的表达各占一半（单/双克隆多克隆1816），呈现单克隆向多克隆逐渐恢复的倾向。    移植后120天至1年的TCR V亚家族的表达 在21例次移植后120天以后的标本中，有10例次为GVHD患者,11例次为无GVHD患者

25、。无GVHD的患者，此时出现以多克隆增生为主的趋势，阳性表达的TCR V亚家族中多克隆较单克隆的表达增加约2倍以上，并且之前呈单克隆表达的亚家族如：V1、V13、V14等也演变为以多克隆增生为主。9例次GVHD患者中,6例次出现以单克隆增生为主的趋势，其中1例患者阳性表达的TCR V亚家族全部为单克隆增生，当时的GVHD反应也是最严重的。另外2例出现多克隆增生为主表现，1例为单克隆和多克隆比例相当的。总的来说，在移植120天以后的TCR V亚家族在GVHD患者主呈现单克隆性增生表现，在无GVHD患者主呈现多克隆性增生表现。    移植后GVHD患者经免疫

26、抑制剂治疗前后的TCR V亚家族的变化 上述病例的研究过程中，我们观察到3例GVHD患者治疗前后随着病情的好转，其TCR V亚家族克隆性增殖出现动态变化，即在发生GVHD或靶器官受累最明显的时候，外周血TCR V亚家族的表达主呈现单/双克隆的表现，而经过免疫抑制治疗病情好转后，部分原来为寡克隆表达的TCR V亚家族，重新出现多克隆增殖趋势（图5）。    Figure 5. TCR V subfamily dynamic changes before and after immunosuppressive treatment of GVHD patien

27、ts. 讨    论    T细胞受体是T淋巴细胞表面的抗原受体，参与抗原的特异性识别，在机体的细胞免疫应答中起着决定性作用。TCR的CDR3区是与抗原表面结合的主位点。CDR3区的长度和序列决定其结构，从而决定TCR的特异性，它如同T淋巴细胞的“指纹”，TCR链V区基因各家族CDR3长度分析可以反映T淋巴细胞的功能状态。本项研究是基于TCR基因重排时所形成的高变区CDR3在不同克隆T细胞中长度不同的原理，经RTPCR扩增不同V亚家族的CDR3，并进一步利用基因扫描分析确定PCR产物的长度，从而了解CDR3长度的均

28、一性，判断T细胞的克隆性7。此项技术又被称为免疫指纹技术（immunoscope）。近年来随着TCRCDR3谱型分析的应用，逐渐认识到一些自身免疫性疾病、肿瘤、感染性疾病患者体内存在特异性的T淋巴细胞克隆性增生。日本学者Furukawa等9在系统性红斑狼疮（SLE）患者体内检测到V8和V13 T淋巴细胞的选择性扩增；Sutmuller等10发现V2在狼疮性肾炎的发病中起到重作用。其他研究也证明， TCR V亚家族的特异性优势表达，参与自身免疫性疾病的病理过程。           &#

29、160;作者：贾新颜,王健民,李扬秋,陈少华,章卫平,陈莉【摘】本研究观察异基因造血干细胞移植(alloHSCT)患者外周         本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。    正常情况下，机体未受任何抗原刺激时，其TCR基因的重排是随机的，表现为多家族和多克隆性，并具有相对稳定性。正常人外周血T淋巴细胞表达所有24个V亚

30、家族，均为多克隆性11。GVHD患者外周血TCR V基因谱系呈优势利用并出现克隆性改变，是由于供体T细胞识别宿主细胞抗原所致的反应性增生。本研究分析了70例次移植后病人的外周血样本，发现移植后T细胞受体的增殖具有一定的动态变化规律：移植治疗之前，ALL患者的增殖主呈单克隆性改变，尤其是TCRV1；移植后患者一般经历由单克隆向多克隆转变的过程，在移植后60-90天时，逐渐由单克隆转为单克隆和多克隆的表达大致各占一半，至120天以后，无GVHD的患者大多转为多克隆表达，而GVHD患者直到1年以后仍有部分TCR亚家族呈单克隆增生的趋势。GVHD患者靶器官受累最明显的时候，外周血TCR V亚家族的表达

31、主呈现单/双克隆，经过免疫抑制剂治疗病情好转后，部分原来为单/寡克隆表达的TCR V亚家族，重新出现多克隆增殖趋势。    这些动态变化的主原因可能与以下几点有关：移植前的单克隆增殖与急性淋巴细胞白血病抗原刺激下肿瘤相关的单克隆增殖，抑制其他克隆的增殖和检测有关11,12；移植后30天的时候，造血重建基本完成，患者外周血恢复正常，但免疫抑制剂的剂量仍较大，在这个阶段无论有否GVHD发生，患者外周血TCR V亚家族的表达均呈现为以单克隆增殖为主的情况；移植后60-90天的时候，随着免疫功能的逐渐恢复，TCR V亚家族的增殖由之前的以单克隆增殖为主转变为单克

32、隆和多克隆的表达各占一半，呈现单克隆向多克隆逐渐恢复的倾向。这一时期是患者移植后服用的免疫抑制剂如CsA,骁悉逐渐减量的时候，随着免疫抑制剂作用的减少，肿瘤抗原的清除，体内T细胞受体的倾向性利用和定向刺激逐渐减少，而向正常的多克隆趋势发展；移植后120天以后，TCR V亚家族的表达情况在有无GVHD的两组患者体内表达出现了差异。无GVHD的患者，此时出现多克隆增生为主的趋势，而GVHD患者则因所处的病情阶段不同而有所差异，免疫抑制治疗较强的患者此时仍为单克隆增殖为主，免疫抑制治疗后病情好转而减量使用的患者此时出现多克隆增殖趋势。移植后1年，是慢性GVHD的好发之时，很多患者出现皮肤、口腔或肝脏

33、等不同的损伤，并使用程度不一的免疫抑制剂治疗，这时T细胞受体的克隆性增殖既受到GVHD本身的影响，又受到免疫抑制剂的抑制作用而呈现较多的单克隆增殖状态。至移植后1年以上，才逐渐由恢复至单克隆和多克隆比例相当的状态。移植1年以上的无GVHD患者，其TCR V亚家族为多克隆性增生表现。本研究结果显示了GVHD患者的TCR V亚家族的动态变化情况，有助于我们进一步了解移植后患者的免疫重建情况。总之，本研究提供了GVHD患者胸腺和外周的T细胞免疫功能状态的情况，为研究GVHD免疫治疗研究提供了一些新资料。但本研究工作尚需再进一步完善，如对PCR反应的稳定性进行更有效的控制，各TCR V亚家族T细胞基因

34、的测序分析，以及增加研究病例数量等等。【参考文献】1Lu J, Basu A, Melenhorst JJ, et al. Analysis of Tcell repertoire in hepatitisassociated aplastic anemia. Blood, 2004; 103: 4588-45932Lee SJ. New approaches for preventing and treating chronic graftversushost disease. Blood, 2005; 105: 4200-42063Deeg HJ, Socie G, Schoch G, e

35、t al. Malignancies after marrow transplantation for aplastic anemia and fanconi anemia: a joint Seattle and Paris analysis of results in 700 patients. Blood, 1996; 87:386-3924Tsihlias J, Kapusta L, Slingerland J. The prognostic significance of altered cyclindependent kinase inhibitors in human cancer. Annu Rev Med, 1999;50: 401-4235Qin Y, Li B, Tan YS, et al. Polymorphism of p16INK4a gene and rare mutation of p15INK4b gene exon2 in primary hepatocarcinoma. World J Gastroenterol, 2000; 6:411-4146Suh SI, Pyun HY, Cho JW, et al. JAza2deoxycytidine leads to down regulation of aberrant p16INK4A R