应用AnnexinV-FITCPI-FCM定量分析对5-FU诱导卵巢癌细胞系凋亡的研究

1、    应用AnnexinV-FITC/PI-FCM定量分析对5-FU诱导卵巢癌细胞系凋亡的研究        【摘要】目的应用AnnexinV-FITC/PI-FCM定量分析5-氟尿嘧啶(5-FU)诱 导卵巢癌细胞系OVC AR发生的凋亡。方法将5-FU以0、20mg/L、100mg/L、20 0mg/L的浓度，分别处理OVCAR细胞12、24、48小时，然后用形态学观察、DNA琼脂糖电泳和A nnexinV-FITC/PI流式细胞技术(flow cytometric,FC

2、M)检测其诱发凋亡的情况。结 果AnnexinV-FITC-FCM分析见，随5-FU作用浓度增加、时间延长，凋亡细胞比例明 显升高，差异显著(P<0.01)，继发性坏死细胞比例增加，差异明显(P<0.05)。 结论 5-FU可以诱发OVCAR细胞发生凋亡，应用AnnexinV-FITC/PI-FCM能对细胞凋亡定性 的同时测出活细胞、凋亡细胞、继发性坏死细胞和培养操作过程中出现机械损伤细胞的比例 ，与传统方法相比，更能直观、准确地反映细胞凋亡与药物浓度及处理时间的关系。【关键词】卵巢癌凋亡5-氟尿嘧啶AnnexinV流式细胞技术Study of ovarian carcinoma

3、cell line apoptosis induced by 5-FU with Annexin V-FITC/PI-FCM quantitative analysisHu Yu,Li Ju,Wang Xiliang(Department of Obstetrics and Gynecology,202 Hospital of PLA,Shenyang 110003)【Abstract】 Objectve Annexin V-FITC/PI-FCM method was used to detect qu antitatively the apoptosis of ovarian carcin

4、oma cell line-OVCAR induced by 5-FU. Method After the cells had been treated respectively for 12、24、48h by 5-FU of 0、20mg/L、100mg/L、200mg/L,we applied morphology,DNA gel electr ophoresis and AnnexinV-FITC/PI flow cytometer method to detect the induced apopt osis condition.Results By AnnexinV-FITC/PI

5、-FCM method,we got the following results :the percentage of apoptotic cell increased significantly due to the higher conc entration and longer treating duration of 5-Fu (P<0.01);and as well,the per centage of secondary necrotic cell increased too,the increasing was obvious( P<0.05).Conclusion

6、5-FU induces OVCAR cell apoptosis.Using A nnexinV-FITC/PI-FCM can identify the percentage of living cell、apoptotic cell 、secondary necrotic cell and mechanical destruction of cell during culture proc e dure.Compared with the traditional methods,AnnexinV-FITC/PI-FCM method can refl ect the relationsh

7、ips of apoptosis with drug concentration and treatment time mo re accurately.【Key words】 Ovarian carcinoma Apoptosis 5-FU AnnexinV Flow cytomete r method迄今，对肿瘤细胞凋亡的研究方法主要为光镜、电镜下的形态学观察，通过琼脂糖电 泳形成典型的“梯形”谱(DNA ladder)，流式细胞技术捕获由断裂DNA形成的亚二倍体 峰等。最近，Vermes应用AnnexinV-FITC/PI-FCM技术1，利用凋亡过程中细胞膜 磷脂不对称性的丧失2，使标有

8、异硫氰酸荧光素(FITC)的膜特异性磷脂结合蛋白A nnexinV与暴露在细胞膜外侧面的磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl serine,PS)结合，同时根据 碘化丙啶(PI)拒染的原理，区分活细胞、凋亡细胞、继发性坏死细胞和培养操作过程中出现 的机械损伤细胞3，并测出各自所占的比例。本文应用此方法检测了5-氟尿嘧啶( 5-FU)诱导OVCAR细胞所发生的凋亡，现将结果报道如下。1材料与方法1.1材料1.1.1卵巢癌细胞株及其培养人卵巢癌细胞系OVCAR，购自中国协和医科大学。细 胞在含 15%的灭活新生牛血清的RPMI1640(GIBCO)培养液中生长，取对数生长期细胞进行实验。培养 箱

9、中二氧化碳的浓度为5%，温度37，饱和湿度。1.1.2药物与试剂5-FU；AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒为美国Genzyme公司产品 ；RNA酶A，蛋白酶K(Sigma)；胰蛋白酶(GIBCO)。1.2方法1.2.1药物处理取对数增长期的细胞，加入5-FU，按终浓度为0、20mg/L、100mg/ L、2 00mg/L与细胞共同孵育12、24、48小时后，用0.25%胰蛋白酶加0.03% EDTA组成的消化液 进行消化，使之成为单细胞，然后用1×PBS漂洗2次，离心后备用。1.2.2形态学观察对生长细胞用倒置显微镜观察；处理后的细胞制备成细胞悬液，涂 片，HE染色，固定封

10、片，光镜观察是否有细胞核的碎裂、染色体边集或凋亡小体的出现。1.2.3琼脂糖电泳分析按常规方法提取DNA。取10l DNA液体与上样液61加样，80 V，电泳2小时，0.5mg/L EB染色，紫外灯下观察。1.2.4AnnexinV-FITC/PI-FCM检测预先配制好染液及缓冲液，置于冰上，取备用细胞 进 行计数，每105106细胞加入100l染色液，于黑暗处放置3045分钟，加入 400l缓冲液轻轻振荡，混匀，上机检测，流式细胞仪型号为BECTON DICKINSON FALSCAN 。1.2.5数据与像分析在二维的FCM分析上，细胞分为四个亚群：左下象限，Annexi nV-FITC-/

11、PI-为活细胞群(V)；右下象限，AnnexinV-FITC+ /PI- 为凋亡细胞(AP)，此区细胞具有典型的凋亡细胞特征：包括细胞与核体积缩小， 染色质浓缩致密，有新月体状核形成，细胞膜上的微绒毛消失；右上象限，AnnexinV-FITC +/PI+细胞已具有了坏死细胞的特征：细胞膜破裂，细胞器肿胀，胞质内空泡 化，为继发性坏死细胞(N)；左上象限，AnnexinV-FITC- /PI+为培养操作过程中出现的机械损伤细胞(O)。最后，所得数据用计算机进行方差 分析统计处理，观察各组间是否有显著差异。2结果2.1倒置显微镜下观察正常的OVCAR细胞呈铺路石状镶嵌，紧密排列，细胞呈多边形、 椭

12、 圆形等多种形态，生长状态良好；经5-FU处理后，12小时20mg/L、100mg/L组无明显反应，2 00mg/L组可见少量细胞收缩变圆，浮起于细胞表面；24小时后，三组细胞均出现体积缩小， 收缩变圆，部分细胞浮起于细胞表面，少量细胞脱离，悬浮于培养液中，以200mg/L组最为 明显；48小时后细胞更多地悬浮于培养液中，100mg/L、200mg/L组部分细胞碎裂成片，涂片 HE染色，三组均见细胞染色质固缩于核的一侧，浓染，或核碎裂形成凋亡小体。2.2琼脂糖电泳未经药物处理的细胞没有小分子DNA片段的形成，经药物处理后的细胞 出现了明显的DNA ladder。2.3AnnexinV-FITC

13、/PI-FCM分析检测结果(表1)显示，当药物浓度增加时，凋亡细胞 的 比例明显升高(P<0.01)，有显著差异，继发性坏死细胞也有所增加(P W TBZ<0.05)，同时正常活细胞逐渐减少；随药物处理时间的延长，继发性坏死细胞增加更 明 显(P<0.05)，尤其在24小时以后更为显著，但凋亡细胞在增至一水平之后相 对 有所减少。由此可见，5-FU能够诱导OVCAR细胞发生凋亡，并且有着明显的浓度依赖和时间 依赖性。表15-FU浓度和作用时间对诱导OVCAR细胞凋亡的影响5-FU(mg/L)12(h)24(h)48(h)VAPNOVAPNOVAPNO091.971.731.3

14、64.7289.572.403 .454.5853.862089.802.044.523.6484.634.286.864.23 79.105.8010.624.4810083.305.357.813.4872.6410.5712.764 .0462.0811.1222.234.5720079.515.4010.663.6468.9414.2413.434 .6251.289.7433.815.173讨论凋亡是指细胞的核酸内切酶被激活，并在核小体间切割DNA链，使DNA降解为以核小体(180 200bp)为单位的片段。在形态学上，HE染色后光镜下可见细胞缩小，核染色浓缩

15、致密，或边 集成新月体状核或碎裂形成凋亡小体，但细胞膜仍保持较好的完整性，其DNA进行琼脂糖电 泳分析呈特征性梯状。形态学的观察较直观地反映了单个细胞凋亡的情况，DNA电泳则反 映了细胞整体凋亡的情况，但是这两种方法所得到的结果比较主观，难以进行准确的数量比 较。本文在利用上述两种方法证明5-FU能够诱导OVCAR细胞发生凋亡的同时，采用AnnexinV- FITC/PI-FCM的方法对同等条件下的标本进行了检测，结果此方法不但证实了5-FU能够诱导O VCAR细胞发生凋亡，而且清晰地区分出活细胞、凋亡细胞和继发性坏死细胞，同时得出凋亡 与药物浓度和处理时间的关系，弥补了前两种方法难以定量的缺

16、陷4。AnnexinV- FITC/PI-FCM的突出特点是检测凋亡细胞的特异性强，分析结果客观，重复性好，使凋亡呈 现出清晰的量变过程，从而协助临床选择恰当的用药浓度、用药时间，有效地启动凋亡机制 ，以达到更好的治疗目的，同时也为进一步探讨化疗药物的作用机制提供了一种较为理想的 模型。作者单位：胡煜(中国人民解放军沈阳军区202医院妇产科沈阳，110003)李巨(中国人民解放军沈阳军区202医院妇产科沈阳，110003)王喜良(中国人民解放军沈阳军区202医院妇产科沈阳，110003)参考文献1，Vermes I,Haanen C,Steffens NH,et al.A novel assa

17、y for apoptosis :flow cytometric detection of phosphatidylserine express on early apoptotic cell s using fluorescein labelled AnnexinV.J Immunol Meth,1995;184( 1):392，Koopman G,Reutelingsperger CP,Kaijten GA,et al.AnnexinV for flow cytomet r ic detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis.Bl ood,1994;84(5):14153，彭黎明.用AnnexinV法定量分析淋巴瘤细胞凋亡与坏死.中华医学