实验一双缩脲法测定蛋白质含量

1、实验一双缩服法测定蛋白质含量实验一:双缩服法测定蛋口质含量一 LI的掌握双缩服法测定蛋口质含量的原理及方法。二原理双缩服（）是两分子尿素经180?左右加热，放出一分子氨（NH）后得到的产物。在强碱溶液中，双缩服与CUS0形成紫色络合物，称为双缩服反应。34其原因是含有两个及以上肽键或类似肽键有化合物都具有类似双缩腺反应。蛋 口质含有多个2+肽键，在碱性溶液中能与CU络合成紫红色的络合物。其颜色的深浅与被测 样品中蛋白质浓度呈正比，而与蛋白质分子量和氨基酸成分无关，故可用来测定蛋 白质含量。该法对样品中蛋白质含量要求相对较高，一般在1-lOmg/L蛋白质。 tris（三中疑基氨基甲烷）、一些氨基

2、酸、EDTA（乙二胺四乙酸）、草二酰胺、多肽等 会于扰该测定。在一定浓度范围内，反应后颜色与被测样品蛋口质含量呈线性关系，即蛋口质 浓度越高，体系的颜色越深。反应产物在540nm处有最大吸收峰（吸光度）。将未知浓度的样品溶液与一系列已知浓度的标准蛋口质溶液同时与双缩腺试剂 反应，并在540nm处比色，可通过标准浓度蛋口质绘制的标准曲线，求得未知样品 中的蛋白质含量（浓度）。由于本法操作简便、迅速、蛋白质浓度与光密度的线性关系好，故对蛋口质快 速而不需要十分精确的测定可用此法。三仪器与器材可见光分光光度计、水浴锅、分析天平、振荡机(器)、漏斗、试管架、具塞三 角瓶(100ml)容量瓶(250 m

3、l、500 ml、1000 ml)、刻度吸管(1.0 ml 2.0 ml 5.0 ml)试管(1. 5cmX15cm)。四试剂1、双缩腺试剂 称取硫酸铜(CUSO95HO) 1. 5g,酒石酸钾钠()426.0g,分别用250 ml蒸憎水溶解后，一并转入1000 m 1容量瓶中，在搅拌下 (可用旋涡混合器或摇动)加入30 mll0%(质量分数)&OH溶液，然后用蒸镭水稀释 至刻度(1000ml) o将该试剂贮存于塑料瓶或内壁涂以石蜡的瓶内。此试剂可长期保 存(须无红色或黑色沉淀出现)，长期使用。2、0. 05 ml/L 的 N&0H (需标定)。3、标准酪蛋白溶液 准确称取0.

4、5 g酪蛋白(干酪素)溶于0.05 ml/L的立0H 溶液中，并定容于100ml,即为5mg/L的标准溶液。4、未知蛋白质溶液 浓度应在1一10mg/L范围内。可根据条件选用小麦粉或家 畜血清，后者需用水稀释10倍，置于冰箱保存备用。五方法与步骤1、标准曲线的绘制 取12支试管分两组，分别加入0. 0ml. 0.2 ml. 0.4ml、0. 6 ml、0.8ml、1.0ml的标准蛋白质溶液,然后分别加入1.0ml、0.8ml、0.6 ml、0.4 ml、0.2ml、0 .0ml蒸镭水，使每支试管总液量为1.0ml,最后分别加入4 ml双缩IK 试剂。充分摇匀后，室温下(2025?)放置30mi

5、n,于540nm处进行比色测定，用未加蛋白质溶液的笫一支试管作为空白对照液，并取两组测定的平均值。以蛋白质 的含量作为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线绘制操作表见下。(共12支管，分两组，只列出一组。)管别每组编号试1 2 3 4 5 6 剂标准蛋白质溶液(ml) 0. 0 0. 2 0. 4 0. 6 0. 8 1. 0 蒸憎水(ml) 1.0 0.8 0. 60.4 0.2 0.0 双缩服试剂(ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蛋白质含量(mg) 0.01. 0 2. 0 3. 0 4. 0 5. 02、样品测定(1) 小麦样品的制备与测定？将磨碎过10

6、0 筛的小麦样品在80?下烘至恒重， 取出置于干燥器中冷却待用。？称取烘干样品约0.2g两份，分别放入两个干燥的三 角瓶中。然后各瓶加入5 mlO. 05 ml/L的aOH溶液湿润，之后再加入场20 ml的 双缩尿试剂(为什么，)振荡15 min,室温静置反应30min,分别过滤(为什么，)，取 滤液在540nm波长处比色，在标准曲线上查出相应的蛋白质含量(mg)(为什么，)。(2) 家畜血清样品的制备与测定？对动物空腹采静脉血，不加抗凝剂(为什么，) 在室温与待自行凝固(5-10 min),通常经3h,血块收缩析出血清。析出血清后及 时分离之， Oml,分别加入4 ml双缩腺以防溶血，并稀释10倍置于冰霜保存。？取两份 血清，每份1试剂，摇匀，37?(为什么，)，20 min后用分光光度计于540nm波长处比色，在 标准曲线上查出相应的蛋口质含量。(3) 每次测定中须用空白管调零。六结果处理X100X酪蛋口的纯度从标准曲线上查得的蛋口质含量(mg)样品蛋白质(紛二样品重(mg)测定管光密度100测定管光密度被测血清总蛋白质(g/100ml)=X0. 05 XX5标准管光密度0 1标准管光密度七注意事项1、三角瓶一定要干燥，勿使样品(小麦粉)粘在瓶壁上。2、若用小牛血清(BSA)蛋口质含量(mg/ml)应以